Plasmides recombinants produisant l'hormone d'adenocorticotropique humaine (acth)

专利摘要:

公开号:WO1989002462A1
申请号:PCT/DE1988/000536
申请日:1988-08-29
公开日:1989-03-23
发明作者:Werner Boidol；Joachim Daum；Peter Donner；Hartmut Seliger；Gerhard Siewert
申请人:Schering Aktiengesellschaft；
IPC主号:C12N15-00

专利说明:
[0001] Re orabinante Plasmide zur Produktion von humanem adrenocorticotropen Hormon (ACTH).
[0002] Das adrenokortikotrope Hormon, abgekürzt ACTH, ist ein Pep- tidhormon, das in den basophilen Zellen des Hypophysenvorder- lappens gebildet wird. In der Literatur ist es auch unter den Bezeichnungen Kortikotrophin oder Kortikotropin bekannt.
[0003] ACTH reguliert die Sekretion von Glukokortikoiden, insbeson¬ dere von Hydrocortison und Cortison, in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde und beeinflußt damit in komplexer Weise den Kohlehydrat-, Eiweiß- und Fettstoffwechsel. Desgleichen wirkt ACTH regulierend auf die Produktion von Sexualhormonen in der Zona reticularis, die das Nebennierenzentrum als inne¬ re Rindenschicht direkt umgibt.
[0004] In der Human-Medizin wird ACTH therapeutisch zur Behandlung entzündlicher und allergischer Prozesse wie rheumatisches Fieber oder Asthma bronchiale eingesetzt. Darüberhinaus ist es in der Klinik für die Diagnostik der Nebennierenrinden- Funktion von Bedeutung. Gegenwärtig stehen dafür zwei Prä¬ parate-Typen zur Verfügung:
[0005] 1) ACTH aus tierischen Quellen, insbesondere angereicherte Extrakte aus Schweine-Hypophysen.
[0006] 2) Mittels Peptid-Synthese hergestellte Präparate eines ge¬ genüber der natürlichen Substanz verkürzten ACTH-Deri- vats.
[0007] Die Aminosäuresequenz des enscl' liehen ACTH wurde durch die Arbeiten von Teh H. Lee et al. [J. Biol. Chem. 236, 2970-2974 (1961) ] und B. Riniker et al. [Nature New Biol. 235, 114-115 (1972) ] aufgeklärt: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Prσ-Val-Gly-Lys-
[0008] 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-
[0009] 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe
[0010] Humanes ACTH unterscheidet sich von Schweine-ACTH lediglich in einer Aminosäure (s. Teh H. Lee et al., I.e. ). Letzteres enthält in Position 31 einen Leucylrest anstelle des Seryl- restes in der Human-Sequenz.
[0011] Aus der Literatur ist bekannt, daß einzelnen Bereichen des natürlichen ACTH-Moleküls unterschiedliche biologische Wir¬ kungen zugeordnet werden können (Review: H.J.M. Goverde, Euro Diagnostics Newsletter No. 4, Januar 1985). Danach ist der N-terminale Bereich der Peptidkette, wie er in den be¬ reits erwähnten synthetischen Handelspräparaten fim wesent¬ lichen Peptide mit der 1 -24-Teilsequenz des natürlichen ACTH (Tetracosactid)] enthalten ist, für die Wechselwirkun¬ gen mit den verschiedenen funktionellen Bereichen der Neben¬ nierenrinde verantwortlich. Andererseits kommt dem C-termi- nalen Anteil des kompletten Peptids eine Schutzfunktion ge¬ genüber biologischen Inaktivierungsprozessen während des ACTH-Transportes im Plasma zu, insbesondere gegen die tryp- tische Spaltung des für die Rezeptorbindung wichtigen ba¬ sischen Peptidanteils im Bereich der Aminosäuren 15-18.
[0012] Die Verfügbarkeit größerer Mengen an reinem ACTH mit der Ami¬ nosäuresequenz des menschlichen Hormons ist demnach von er¬ heblichem medizinischen und wissenschaftlichen Interesse. Ei für die biotechnische Herstellung von humanem ACTH und davo abgeleiteten Peptidderivaten geeignetes Verfahren ist demge mäß Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Es gehört bereits zum allgemeinen Wissensstand, Strukturgene, die für die zelluläre Synthese medizinisch ein setzbarer Proteine oder Peptide codieren, gezielt in indu striell fermentierbare prokaryotische oder eukaryotische Zel len einzubringen und dort stabil zu etablieren. Dieser Vor gang wird als Transformation bezeichnet. Mittels geeignete Selektionsverfahren lassen sich genetisch identische Zellpo pulationen (Klone) erhalten, die alle über das artifiziel eingeführte Gen verfügen. Durch Ergänzung solcher in-vitr eingeschleuster Strukturgene um bestimmte Kontrollelemente, die mit dem Proteinsynthese-Apparat der jeweiligen Wirtszelle korrespondieren können, läßt sich in vielen Fällen die be¬ reits erwähnte Expression des fremden genetischen Materials, d.h. dessen Übersetzung in das gewünschte Genprodukt, errei¬ chen. Die wichtigsten experimentellen Möglichkeiten zur Her¬ stellung solcher Expressionsklone sind heute allgemeine Standard des molekularbiologischen Wissens und in zahlreiche Publikationen beschrieben [z.B. W. Gilbert und L. Villa-Koma- roff, Scientific American 242, 68-82 (April 1980) ; A. Aharo- nowitz und G. Cohen, Scientific American 245, 106-118 (Sept. 1981); E.-L. Winnacker in Gene und Klone, S. 191-260 (VC Verl. Weinheim, 1985)].
[0013] Der Gentechnologie fällt in diesem Zusammenhang vor allem die Aufgabe zu, das Verfahrensspektrum zur in-vitro-Bearbeitun von genetischem Material, d.h. von DNS-Fragmenten mit seh verschiedenen physikalisch-chemischen und biologischen Eigen¬ schaften, zu entwickeln und zu erweitern.
[0014] Die Konstruktion eines Zellklons, der in der Lage ist, die genetische Information von künstlich eingeschleuster Fremd- DNS in die Synthese entsprechender Fremd-Proteine zu über-__ setzen, folgt im Prinzip immer dem gleichen Verfahrensmuster:
[0015] 1. Man stellt ein DNS-Fragment bereit, das die gewünschte genetische Information enthält. Dafür gibt es mehrere Möglichkeiten. Im einfachsten Fall kann man es enzyma- tisch aus der DNS einer geeigneten Spender-Species her¬ ausschneiden, eine häufig benutzte Methode, wenn der Spender ein Prokaryont ist. Andererseits läßt sich ein Gen durch reverse Transcription aus Messenger-RNS enzy- matisch synthetisieren (cDNS-Verfahren) . Eine weitere Möglichkeit bietet die chemische Synthese von Oligonu- kleotiden und deren enzymatische Verknüpfung zum ge¬ wünschten Genfragment.
[0016] 2. Man integriert das gewünschte DNS-Fragment, gegebenen¬ falls um Steuereinheiten für die Expression ergänzt, enzymatisch in eine sogenannte Vektor-DNS (Detailshie zu s. obengenannte Literaturzitate).
[0017] 3. Die entstandene Genkonstruktion verfügt über die erfor¬ derlichen Funktionen zur Einschleusung des Fremdgens in geeignete Wirtszellen und zu dessen stabiler Etablierung in einer autonom replizierenden oder in das Wirtschromo¬ som eingebauten Expressionseinheit sowie über Markerfunk¬ tionen für die Selektion von erfolgreich transformierte in-vitro-rekombinierten Klonen.
[0018] Für die Entwicklung biotechnischer Verfahren mit gentechnisc konstruierten Expressionsklonen sind prokaryotische Wirtsor ganismen besonders attraktiv. Sie lassen sich relativ kosten günstig unter Einsatz etablierter Verfahrenstechniken fermen tieren und sind in einigen Fällen genetisch gut untersucht Letzteres gilt vor allem für das Darmbakterium Escherichi coli und davon abgeleitete apathogene Laborstämme wie E.col K12.
[0019] Für die biotechnische Synthese von Fremdproteinen in E.col sind in den letzten Jahren zahlreiche Beispiele beschriebe worden, darunter viele, die die Herstellung von Genprodukte eukaryotischer Herkunft betreffen [Review z.B. F.A.O. Mar ston, Biochem. J. 240, 1-12 (1986); weitere Referenzen s dort]. Dabei lassen sich drei Typen von Expressionsklone unterscheiden: 1. Klone, bei denen das fremde Strukturgen allein zwisch E.coli- Transcriptions-, Translations- und Ter ination signale eingebaut und im Cytoplasma in nativer Form d rekt expri iert wird [z.B. D.V. Goeddel et al., Natu 281, 544- 548 (1979) ].
[0020] 2. Klone, bei denen das fremde Strukturgen zusätzlich Codo für eine vom E.coli-System spaltbare Signalpeptidseque vor dem Aminoterminus im richtigen Leseraster enthäl Solche Klone sind in der Lage, das primäre Genprodu korrekt zu prozessieren und das Fremdprotein in nativ Form in den periplasmatischen Raum zu sezernieren [z. G.W. Becker und H.M. Hsiung, FEBS Left. 204, 145-1 (1986) ].
[0021] 3. Klone, bei denen das fremde Strukturgen N-terminale Ve längerungen durch wirtsspezifische Kontroll- und Stru turgene im Leseraster besitzt. Sie synthetisieren ein a E.coli-Proteinen und dem Zielprotein zusammengesetzt Fusionsprotein, das im allgemeinen im Cytoplasma ve bleibt [z.B. D.V. Goeddel et al. , Proc. Nat. Acad. Sei USA 76./ 106-110 (1979) ].
[0022] Die Fusion mit wirtsspezifischen Genen und die resultierende Expression als Fusionsproteine erlaubt auch die biotechnische Synthese kurzkettiger Zielpeptide in E.coli [z.B. J. Shine et al., Nature 2Z5__r 456-461 (1980)]. Derart kleine Peptide kön¬ nen in E.coli-Zellen nicht direkt synthetisiert werden, weil sie über keine feste Raumstruktur verfügen und deshalb von cytoplasmatisch vorhandenen Wirtsproteasen bevorzugt abgebaut werden [vgl. K. Itakura et al., Science 198, 1056-1063 (1977)]. Als Teile von Fusionsproteinen lassen sie sich dage¬ gen unter geeigneten Bedingungen in guten Ausbeuten gewinnen. Die spezifische Spaltung solcher Primärprodukte unter Frei¬ setzung des nativen Zielpeptids stellt ein allgemeines Pro¬ blem dar, für dessen Lösungen eine Reihe von Einzelbeispielen beschrieben wurden [vgl. F.A.O. Marston, Biochem. J. 240, 1-12 (1986) . Alle diese Verfahren sind von charakteristische Eigenschaften der entsprechenden Fusionsproteine abhängig und damit in ihrer allgemeinen Anwendbarkeit limitiert [vgl. H. Scheidecker et al. , Deutsche Patent-anmeldung, Aktenzeichen P 3731875.6] .
[0023] Dies trifft auch für eine bereits anwendungstechnisch einge¬ setzte Methode zu, bei der die Möglichkeiten zur Spaltung von -Met-X-Bindungen (X = N-terminale Aminosäure des Zielpeptids) an der Carboxylgruppe des Methionins mit Bro cyan genutzt wird. Dieses Verfahren ist nur dann anwendbar, wenn das ge¬ wünschte Peptid, wie im Falle der A- und B-Ketten des Human¬ insulins, keine weiteren intramolekularen Methionylreste ent hält [vgl. D.V. Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76, 106-110 (1979) ]. Für viele andere Beispiele, und zu die sen gehört auch das humane ACTH, ist die erwähnte Vorausset zung jedoch nicht erfüllt. So würde eine Bromcyan-Spaltun entsprechend konstruierter ACTH-Fusionsproteine wegen des zu sätzlichen Methionylrestes im N-terminalen Bereich des Ziel peptids (vgl. Struktur des_..ACTH S. 3) zu einer Fragmentierun des gewünschten Produktes führen. Experimentelle Alternative für Beispiele dieses Typs bietet ein neues spezifisches und hoch effizientes Spaltverfahren mit sehr breitem Anwendungs¬ bereich, das m der parallel eingereichten deutschen Patent¬ anmeldung (Aktenzeichen P3731875.6⁾beschrieben wird.
[0024] Fusionsproteine, die nach diesem Verfahren spezifisch gespal¬ ten werden sollen, müssen so konstruiert sein, daß sich zwi¬ schen dem Amino-Ende des Zielpeptids und dem Carboxyl-Ende das bakteriellen Anteils eine zumindest einmal wiederholte Tetrapeptid-Erkennungssequenz für Kollagenasen vom Typ Clo- stridiopeptidase A befindet. Solche Konstruktionen weisen also die allgemeine Struktur auf:
[0025] H₂N-bakterieller Sequenzanteil-Gly-(Pro-X-Gly)_n~Pro-Zielpep- tid-COOH (n » 2) .
[0026] (Dabei gilt in Abhängigkeit von der Peptidsequenz n = 1, für die meisten Beispiele jedoch n > 1.)
[0027] [Einzelheiten s. parallele Patentanmeldung G. Siewert et al. (1987) ]. Nach der Kollagenasespaltung erhält man als primäres Spalt¬ produkt das am N-Teππinus um das Dipeptid Gly-Pro verlängerte Zielpeptid, das sich durch Abspaltung des Glycylprolins mit¬ tels Postprolin-Dipeptidyl-Aminopeptidase (PPDA) quantitativ in die native Form umwandeln läßt (s. EP 20290).
[0028] Die Anwendung dieser gentechnischen Methoden zur Konstruktion in-vitro-rekombinierter Escherichia coli-Stämme für die bio¬ technische Herstellung kleiner und mittlerer Peptide ist auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Sie beschreibt im be¬ sonderen eine neue biotechnische Herstellungsmethode für das adrenokortikotrope Hormon (ACTH) oder von Derivaten dieses Wirkstoffes wie ACTH 1-24 (Tetracosactid) oder um eine oder mehrere^"Aminosäuren verlängertes ACTH. Dieses Verfahren um¬ faßt die folgenden Einzelschritte:
[0029] 1. Die in-vitro-Konstru tion von Escherichia K12-Klonen, die ACTH oder ACTH-Derivate (z. B. ACTH 1-24, um eine oder mehrere Aminosäuren verlängertes ACTH oder ein ACTH, in dem eine oder mehrere Aminosäuren durch andere Aminosäu¬ ren substituiert wurden) als C-Terminus von spezifisch spaltbaren Fusionsproteinen mit N-terminalen Proteinan¬ teilen der E.coli-spezifischen alkalischen Phospatase Anthranilat-Synthetase, ß-Lactamase, ß-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase usw. expri ieren. Dazu wurden synthetisch hergestellte Gensequenzen für ACTH bzw. für die ACTH-Derivate gentechnisch in speziell Expressonsvektoren integriert, bei denen durch den Einba eine DNS-Sequenz entsteht, die zusätzlich für eine Erken nungsschnittstelle für Kollagenasen des Typs Clostridio- peptidase A zwischen den N-terminalen Anteilen des Prä¬ proteins der alkalischen Phasphatase und dem jeweiligen ACTH-Anteil codiert. Expressionsklone dieses Typs gestat ten die Erzielung hoher Proteinäusbeuten durch Nutzung des phoA-Regulationssystems , d.h. durch optimale Dosie¬ rung des Phosphatgehaltes in den Nährmedien. Zugleich bietet die vorhandene Erkennungssequenz für Kollagenase die Möglichkeit zur enzymatischen Freisetzung von Gly- Pro-ACTH, Gly-Pro-ACTH 1-24 oder anderer ACTH-Derivate, wie sie oben bereits genannt wurden, die sich mit PPDA den nativen Proteohormonen weiterspalten lassen (vgl. hierzu EP 20290) .
[0030] 2. Die in-vitro-Integration der Gensequeπzen für ACTH, AQT 1-24 oder andere ACTH-Derivate, wie sie oben bereits ge¬ nannt wurden, in verbesserte EspressionsVektoren, die N terminal zur potentiellen Einbauposition Codons für zu¬ sätzliche Kollagenaseerkennungssequenzen besitzen. Ex¬ pressionsvektoren dieses Typs werden in einer parallel eingereichten deutschen Patentanmeldung (Aktenzeichen p 3731875.£)detailliert beschrieben. Die resultierenden ge technisch verbesserten Rekombinationsklone ermöglichen die gleichen hohen Syntheseraten für die entsprechenden
[0031] Fusionsproteine, wie die unter Schritt 1 beschriebenen ACTH-Klone. Anders als diese gestatten sie jedoch eine für die biotechnische Nutzung entscheidende, um Größen¬ ordnungen beschleunigte (vgl. Tab. 2) und quantitative Freisetzung von z. B. Gly-Pro-ACTH bzw. Gly-Pro-ACTH 1-24.
[0032] 3. Die Entwicklung von Verfahren, die eine biotechnische Fermentation und Aufarbeitung von ACTH, ACTH 1-24 und anderer ACTH-Derivate gestatten. Diese Methodik ist vor allem dadurch gekennzeichnet, daß die besonders für re¬ lativ niedermolekulare Fremdproteine charakteristischen Produkteinbußen infolge unspezifischen Abbaus durch Escherichia coli-Proteasen minimiert werden konnten.
[0033] Die vorliegende Erfindung betrifft Plasmidvektoren, die ei ne DNS-Sequenz für ACTH oder ACTH-Derivate enthalten und mit denen Bakterien zu Zellen, die diese Vektoren enthalte transformiert werden können. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung dieser Plasmidvektoren, die da¬ durch gekennzeichnet sind, daß man DNS-Insertionsfragmente, die die Codons für ACTH oder ACTH-Derivate enthalten und die an beiden Enden Pstl-Erkennungssequenzen besitzen, in die Pstl-Schnittstelle linearisierter und dephosphoryliert Vektorplasmide unter Zuhilfenahme geeigneter Ligasen ein¬ fügt sowie E.coli-Stämme, enthaltend Plasmide mit einem Ge für ACTH oder ACTH-Derivate. Außerdem betrifft die vorlie¬ gende Erfindung Verfahren zur Herstellung neuer E.coli- Stämme, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man kompetent Zellen des betreffenden Stammes mit der Plasmid-DNS für AC oder ACTH-Derivate unter Transformationsbedingungen inkubi und aus der Zellenpopulation ACTH-Klone mit Antibiotika- Resistenz isoliert sowie die Verwendung dieser neuen E.coli-Stämme zur Herstellung von ACTH oder ACTH-Derivaten
[0034] Die Erfindung umfaßt ebenso ein Verfahren zur Herstellung neuer E.coli-Stämme nach an sich bekannten Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man kompetente Zellen von E.coli E 15 mit einem hohen Überschuß an Plasmid-DNS für ACTH oder ACTH-Derivate aus E.coli SB trans ormiert, und die Verwendung dieser transformierten E.coli E 15-Stämme zur Herstellung von ACTH und ACTH-Derivaten. Insbesondere seien Verfahren zur Herstellung von ACTH genannt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man die neuen Stämme (s. Ansprüche 13 - 26) aus einer Vorkultur mit einer wäßrigen Lösung von L-Prolin, L-Leucin, Casatπino acids, Vitamin B 1 in konzentriertem Niedrig¬ phosphat-Medium in einem Fermenter kombiniert, bei 37 °C und Überdruck rührt und das gebildete ACTH nach bekannten Verfahren isoliert. Die entstandenen ACTH-haltigen Fusionsproteine werden einer Kollagenase- und Post- Prolin-Dipeptidyl-Aminopeptidase-Spaltung unterworfen. Die Erfindung betrifft schließlich Arzneimittel, enthaltend ACTH oder ACTH-Derivate, die nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden können und übliche Hilfs- und Trägerstoffe.
[0035] Am 25.07.1987 wurden bei der DSM, Göttingen folgende Stämme hinterlegt:
[0036] Escherichia coli E 15 (DSM 4190)
[0037] Escherichia coli SB 44 (pSA 125) (DSM 4191 ) Escherichia coli HB 101 (pSA 504) (DSM 4192) Escherichia coli HB 101 (pSA 271 ) (DSM 4193)
[0038] Am 16.07.1979 wurden bei der American Type Culture Collec- tion (ATCC) in Rockeville, Md. , USA hinterlegt:
[0039] Plasmid pBR 322 (ATCC 40015)
[0040] Plas id pSB 53 (ATCC 40020)
[0041] Escherichia coli SB 44 (pSB 53) (ATCC 31542)
[0042] _Am 16.07.1979 wurden bei der DSM, Göttingen hinterlegt: Escherichia coli SB__44 ⁽DSM 1606⁾
[0043] Escherichia coli HB 101 ⁽DSM 1607⁾
[0044] Seit dem 26.11.1973 liegt bei der DSM eine Hinterlegung vor fü :
[0045] -Escherichia coli K 12 Wildtyp ⁽DSM 498⁾
[0046] Materialien und Methoden, soweit sie bei den Experiment-Beschreibungen nicht gesondert angegeben werden
[0047] Enzyme: Beschreibung der Bezugsquelle:
[0048] Restriktions- Boehringer/Mannheim endonukleasen: Pharmacia/P-L, 7800 Freiburg i. Br.
[0049] New England Bio Labs GmbH,
[0050] 6231 Schwalbach
[0051] Gibco/BRL, 75H Eggenstein
[0052] International Biotechnologies Inc. ,
[0053] New Haven, CT, U.S .A.
[0054] T4-Ligase: Boehringer/Mannheim
[0055] New England Bio Labs GmbH,
[0056] 6231 Schwalbach
[0057] Pharmacia/P-L, 7800 Freiburg i. Br
[0058] DNS-Polymergase Boehringer/Mannheim
[0059] (Klenow-Fragment) : Pharmacia/P-L, 7800 Freiburg i. Br.
[0060] Universalprimer für die Gibco/BRL, 7514 Eggehstein Sequenzierung mittels M13mp18- und M13mp19- Subklonen (vgl. Standard¬ verfahren A 2. )
[0061] alkal. Phosphatase aus Kälberdarm: Boehringer/Mannheim
[0062] T4-Polynukleotidkinase: Pharmacia/P-L, 7800 Freiburg i. Br. Wirtsstämme für in vitro rekombinierte DNS-Konstruktionen:
[0063] E. coli SB 44 W. Boidol, Dissertation Freie Universität Berlin
[0064] Genotyp: (1984); proA leuB lacZ thi G. Siewert et al. , recA hsdR hscM SupE US-Pat. Nr. 4375514 (1983) str phoA
[0065] E. coli E 15 S.J. Hayashi et al., 3 . Biol. Chem. 239 phoAδ relA1 tonA22 3098-3106 (1964)
[0066] T E.coli Genetic Stock Center,
[0067] 2
[0068] New Haven, Connecticut, USA
[0069] Radioaktive Chemikalien: Amersham Buchler, 3300 Braunschweig
[0070] New England Nuclear, 6072 Dreieich
[0071] Puf erSubstanzen: Merck, Darmstadt
[0072] A) Standard-Verfahren
[0073] A 1. Plasmid-Isolierung
[0074] Zur Herstellung gereinigter Plasmid-DNS wurde nach den bei T. Maniatis et al. [in: 'Molecular Cloning' , Cold Spring Harbo Lab., New York, (1982) ] beschriebenen Methoden verfahren.
[0075] A 2. DNS-Sequenzierung
[0076] Hierfür wurde das enzymatische Didesoxynu leotid- Kettenabbruch-Verfahren nach Sanger et al. [Proc.Nat. Acad. Sei J . 5463-5467, (1977) 3 benutzt. Die erforder¬ lichen DNS-Einzelstrang-Matrizen wurden nach Re-Klonie- rung der zu analysierenden DNS-Abschnitte in die M13-P ageπ mp18 und mp19 [allgemein käuflich; 3 . Mes¬ sing, R. Crea und P.H. Seeburg, Nucl. Ac. Res. 9_, 309-321, (1981) ; C. Yanisch-Per _*ron, J. Vieira und J. Messing, Gene —3—3 ,
[0077] 103-119, (1985) ] erhalten. Zur radioaktiven Markierung de resultierenden Polymeraseprodukte wurde nach Biggin et al.
[0078] [Proc. Nat. Acad. Sei. 8_0, 3963- 3965, (1983) ] Desoxyadeno sin-5'-[oc- 35S]thio-triphosphat im Substratgemisch eingesetzt.
[0079] Die Auftrennung der entstandenen radioaktiven DNS-Fragment erfolgte mittels Gelelektrophorese in 0.1 mm dünnen, thermo statisierten (60° C) Polyacrylamid/Harnstoffgelen nach . An sorge und L. de Maeyer [J. Chromat. 202, 45-53, (1980) ] un ter Einsatz des Macrophor -Trennsystems der Firma LKB Instru ments.
[0080] A 3. Oligonukleotidsynthese
[0081] Oligonukleotide wurden, soweit nicht im Fachhandel [z.B. Boehringer/Mannheim oder Pharmacia/P-L] ab Lager verfügbar, mittels Festphasen/Phosphotriester-Methodik, teilweise unte Benutzung eines Synthese-Automaten der Firma Applied Bio systems GmbH, 6108 Weiterstadt, hergestellt. Eingesetzt wurd der Typ 381 A, die Aufarbeitung und Reinigung erfolgte gem den Angaben des entsprechenden Benutzer-Handbuches.
[0082] E A 4. Oligonukleotidgesteuerte Mutagenese
[0083] Dieses Verfahren wurde nach der bei M.J. Zoller und M. Smith [DNA 3_, 479-488, (1984) ] beschriebenen Modifikation durchge¬ führt. Die Mutanten-Identifizierung erfolgte durch selektive
[0084] Hybridisierung der Ml3-Mutanten-Plaques mit dem [ 32P]-mar- kierten Mutagen-Primer-Nukleotid unter Anwendung des soge¬ nannten 'Plaque-Lift'-Verfahrens nach W.D. Benton und R.W. Davis [Science 196, 180- 182, (1977) ] und der *Dot Blot*-Me¬ thode in der bei M.J. Zoller und M. Smith [Nucl. Ac. Res. 10, 6487-6500, (1982) ] beschriebenen Form.
[0085] A 5. Charakterisierung von Fusionsproteinen durch ' Immun-Blotting'
[0086] Dieses Indentifizierungsverfahren für Expressionsprodukte, die Teile des Präpeptids der E.coli-spezifischen alkalische Phosphatase enthalten, wurde nach H. Towbin, T. Staehelin J. Gordon [Proc. Natl. Acad. Sei. 1__, 4350-4354 (1979) durchgeführt. Ein primäres Antiserum ließ sich nach Immuni sierung von Kaninchen unter Standardbedingungen [vgl. D.M Weir, Handbook of Experimental Immunolgy, Vol. III, Blackwel Scientific Publ., Oxford (1978) ] mit hochgereinigter alkali scher Phosphatase aus Escherichia coli isolieren.
[0087] Als zweiter Antikörper wurde mit alkalischer Phosphatase kon jugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen IgG eingesetzt [Fa. Cappel vertreten durch Cooper Biomedical, 6000 Frankfur /Main 1] Die Farbreaktion erfolgte durch Zusatz von 5-Brom-4-chlor-3 indolylphosphat.
[0088] ERSATZBLATT - 15 -
[0089] A 6.5. Isolierung der unlöslichen Proteine:
[0090] Mittels 20 Min. Zentrifugation bei 0 °C und 48 000 x g werde die unlöslichen Zellaufschluß-Produkte sedi entiert. Durc zweimaliges Resuspendieren in je 20 ml 50 mM Tris/HCl pH 8 160 mM NaCl und 10 Min. Rezentrifugation unter obigen Bedin gungen lassen sich die Sedimente frei von löslichen Zeilin haltsstoffen erhalten. Sie werden unter Benutzung eine Dounce-Homogenisators in je 3 ml 8 M Guanidin ^* HC1 resuspen diert, für 1 Std. auf 95 °C erhitzt und anschließend auf Eis temperatur gekühlt. ACTH- Fusionsproteine gehen unter diese Bedingungen stabil in Lösung und lassen sich nach 30 Min Zentrifugieren unter obigen Bedingungen als überstand erhal ten. Nach 16 Stunden Dialyse bei 2 °C gegen 4 1 50 mM Tris HC1 pH 8, 160 mM NaCl erhält man die Proteine in je 4 ml Dia lysat als feindisperse Suspension, die in dieser Form direk für die Kollagenaseverdauung eingesetzt oder bei -20 °C auf bewahrt werden kann.
[0091] A 6.6. Kollagenase-Verdauung
[0092] Die spezifische Spaltung der ACTH-Fusionsproteine erfolg zweckmäßig mit einem hoch gereinigten Kollagenasepräparat das sich durch FPLC-lonenaustauschchromatographie [vgl. Deu Patentanmeldung Aktenzeichen P 37 31 875.6] der kommerziell verfügbaren Clostridiopeptidase A (EC 3.4.24.3) aus Clostri dium histolyticum [Typ VII; Sigma GmbH] erhalten läßt.
[0093] Für Standardanalysen wird eine Proteinmenge, die 100 |i Hauptkultur äquivalent ist, das sind 4 μl Proteinsuspensio (Dialysat) , in 10 μl 50 M Tris/HCl pH 8 , 5 mM CaCl- mit Wunsch-Einheiten [vgl. E. Wünsch et al., Hoppe Seyler's Z Physiol. Chem. 333, 149-151 (1963) ] Clostridiopeptidase A fü 1 Std. bei 37 °C inkubiert. Danach können die Spaltprodukt direkt auf SDS-Polyacrylamidgelen unter Standardbedingunge [U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970) ] getrennt, in Ggw von 0,2 % Coomassie Blau G-250 angefärbt und mittels des obe beschriebenen Immun-Blotting-Verfahrens (vgl. A 5) charakte risiert werden. B) Standard-Lösungen:
[0094] B 1. Reaktionspuffer für enzy atische"Umsetzungen
[0095] B 1.1. Restriktionsendonukleasen
[0096] Hierfür wurden, soweit bei den Einzelbeispielen nicht geson¬ dert angegeben, 3 Basispuffer nach T. Maniatis et al. [T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in: 'Molecular Clon- ing', S. 100-101 und 104-106, Cold Spring Harbor Lab., New York (1982) ] benutzt:
[0097] Low buffer: 10 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreit pH 7.5
[0098] Medium buffer: 50 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl, 10 M MgCl₂, 1 mM
[0099] Dithiothreit, pH 7.5
[0100] High buffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, -10 mM mgCl₂,
[0101] 1 mM Dithiothreit, pH 7.5
[0102] B 1.2. Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm
[0103] Hierfür wurden die bei T. Maniatis et al. [in: 'Molecular Cloning¹, S. 133-134, Cold Spring Harbor Lab., New York (1982) ] beschriebenen Lösungen eingesetzt.
[0104] B 1.3. T4 DNS-Ligase
[0105] 50 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP, 50 μg/ l Rinderserumalbumin, pH 7.8
[0106] B 1.4. Polynukleotid-Kinase
[0107] (aus T4-transfiziertem E.coli B)
[0108] 100 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit, pH 8.3 B) Standard-Lösungen:
[0109] B 1. Reaktionspuffer für enzymatische Umsetzungen
[0110] B 1.1. Restriktionsendonukleasen
[0111] Hierfür wurden, soweit bei den Einzelbeispielen nicht geson dert angegeben, 3 Basispuffer nach T. Maniatis et al. [T Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in: 'Molecular Clon ing', S. 100-101 und 104-106, Cold Spring Harbor Lab., Ne York (1982) ] benutzt:
[0112] Low buffer: 10 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothrei pH 7.5
[0113] Medium buffer: 50 M NaCl, 10 M Tris/HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM
[0114] Dithiothreit, pH 7.5
[0115] High buffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 10 mM gCl₂,
[0116] 1 mM Dithiothreit, pH 7.5
[0117] B 1.2. Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm
[0118] Hierfür wurden die bei T. Maniatis et al. [in: 'Molecula Cloning' , S. 133-134, Cold Spring Harbor Lab., New Yor (1982) ] beschriebenen Lösungen eingesetzt.
[0119] B 1.3. T4 DNS-Ligase
[0120] 50 M Tris/HCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithioerythrit, 1 M ATP 50 μg/ml Rinderserumalbumin, pH 7.8
[0121] B 1.4. Polynukleotid-Kinase
[0122] (aus T4-transfiziertem E.coli B)
[0123] 100 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl₂ , 10 mM Dithiothreit, pH 8.3
[0124] ERSATZBLATT B 2. Lagerpuffer für DNS
[0125] 'TE-Puffer^!: 45 M Tris/HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.9
[0126] B 3. Elektrophoresepuffer
[0127] B 3.1. 'TBE-Puffer' : 90 mM Tris/HCl, 80 mM H₃B0₃,
[0128] 2.5 mM EDTA, pH 8.3 B 3.2. 'TAE-Puffer' : 40 mM Tris-Acetat, 2 mM EDTA, pH 8.
[0129] B 3.3. Arbeitspuffer zur gelelektrophoretischen Protein- Trennung nach V.K. Laemmli [Nature 227 , 680-685 (1970) ]
[0130] 0.25 M Tris, 0.192 M Glycin, 0.1 % SDS, pH 8.3
[0131] B 4. Puffer zur Extraktion von DNS aus Polyacrylamid- Gelen
[0132] 0.5 M Ammoniumacetat, 1 mM EDTA, pH 8.0
[0133] B 5. Puffer zur Elektroelution von DNS aus Agarosegelen
[0134] 45 mM Tris/HCl, 40 M H₃B0₃, μ.25 mM EDTA, pH 8.3
[0135] B 6. Puffer für Selektion bakterieller Mutanten nach de Kolonie-Filterhybridisierungsmethode
[0136] Alle benötigten Puffer-Lösungen wurden eingesetzt, wie be R.B. Wallace et al. beschrieben [Nucl. Ac. Res. 9_, 879-89 (1981) ].
[0137] B 7. Puffer für die 'DOT BLO '-Identifizierung von M13-Phagen- Plaques
[0138] Alle benötigten Pufferlösungen wurden eingesetzt, wie be M.J. Zoller und M. Smith beschrieben [Nucl. Ac. Res. 10 6487-6500 (1982) 1. C) Ausführungs-Beispiele
[0139] C 1. Herstellung des Expressionsklons E.coli SB 44 (pSA 172)
[0140] Dieser Klon synthetisiert ein Fusionsprotein, das aus de N-terminalen Aminosäuren 1-446 des Präpeptids der alkalische Phosphatase [M. Simonis, Dissertation Freie Universität Ber lin, Berlin (1983) ], gefolgt von der Kollagenaseerkennungsse quenz -Pro-Ala-Gly-Pro- und der ACTH-l-24-Sequenz (SA 172) besteht:
[0141] Alk. Phosphatase (1-446) -Pro-Ala-Gly-Pro-ACTH 1-24 ι i
[0142] Kollagenase- Erkennungs- SA 172 Sequenz
[0143] C 1.1. Integration eines 86 Bp-Pstl-Restriktionsfrag ente mit Codons für ACTH 1-24 in die Pstl-Schnittstell in Position 1624 des phoA-Plasmids pSA 125 [hinte legt als E.coli SB44 (pSA 125) = DSM 4191J .
[0144] [vgl. Abb. 1}
[0145] C 1.1.1. Herstellung des linearen Vektorplas ids
[0146] 1 μg pSA 125-DNS wurde in 50 μl 'Medium buffer' (Lsg. B 1.1. mit 0.43 Einheiten PstI [Boehringer/Mannheim] für 5 min be 37 °C inkubiert. Unter diesen Bedingungen findet eine Parti alverdauung des Plasmids statt. Das Reaktionsgemisch wurd 15mM an EDTA gemacht und das Enzym dadurch inaktiviert. Di beiden linearen 6458 Bp-Fragmente ließen sich in 0.7 % Aga rose gelelektrophoretisch trennen (Puffer B 3.2.) und wurde mit Hilfe einer Ethidiumbromid-gefärbten Marker-DNS identifi ziert. Die Isolierung der DNS erfolgte durch Elektroelutio in 1 ml Elutionspuffer (Lsg. B 5.) nach Maniatis ^• et al. [i 'Molecular Cloning' , S. 164-165, Cold Spring Harbor Lab., N York (1982) ]. Die Lösung wurde mittels einer 2 ml-Einwe spritze in Adsorptionspuffer (TE-Puffer, Lsg. B 2. + 0.2 NaCl) an einer Fertigsäule [Typ Elutip-d der Fa. Schleich & Schüll] adsorbiert und nach Herstellerangaben behandel Die Desorption wurde entsprechend mit TE-Puffer (Lsg. B 2.) 1 M NaCl vorgenommen und ergab 0.5 ml Eluat. Durch Zugabe v 1 ml Äthanol, 3 Std. Temperieren bei -25 °C und nachfolgen Zentrifugation (10 Min., 12 000 x g) ließ sich das 6458 B DNS-Gemisch in reiner Form ausfällen und sedimentieren.
[0147] C 1.1.2. Dephosphorylierung des linearen Vektorplasmids
[0148] Die DNS wurde in 5 μl TE-Puffer (Lsg. B 2.) gelöst und 10 μl Reaktionsvolumen mit alkalischer Phosphatase aus Kä berdarm nach Maniatis et al. (Lösungen gemäß B 1.2.) depho phoryliert. Nach Extraktion mit 300 μl TE-gesättigten Pheno und zweimaliger Extraktion mit je 600 μl Äther wurde 150 an NaCl gemacht und mit 0.5 ml Äthanol (wie in C 1.1.1. b schrieben) gefällt und sedimentiert.
[0149] C 1.1.3. Herstellung des ACTH 1-24-DNS-Insertionsfragment
[0150] Ein 86 Bp-DNS-Fragment mit Pstl-Erkennungssequenzen an bei Enden, das die Codons für ACTH 1-24 enthält, wurde aus Plasmid pSA 271 (vgl. Abb. 2) [hinterlegt als E.coli HB 101 (pSA 271 ) = DSM 4193].
[0151] 50 μg pSA 271-DNS wurden in 200 μl 'Medium buffer' (Lsg. 1.1.) mit 198 Einheiten PstI [Boehringer/Mannheim] für 2 S bei 37 °C inkubiert. Nach Extraktionen mit 200 μl TE-Puff gesättigten Phenols und 2x 400 μl Äther wurde 0.3 mM an Acetat gemacht und mit 500 μl Äthanol für 20 min bei -80 temperiert. Das DNS- Gemisch ließ sich durch 20 Min. Zent fugieren bei 12 000 x g sedimentieren und wurde in 10 μl Puffer (Lsg. B 2.) und 2 μl Ladungspuffer Typ II [T. Mani tis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in: 'Molecular Cloning', 160, Cold Spring Harbor Lab., New York (1982)] gelöst. Das Bp-Fragment konnte nach gelelektrophoretischer Trennung einem 8 % Acryla idgel ausgeschnitten und nach Maniatis al. [in: 'Molecular Cloning', S. 178, Cold Spring Harb Lab., New York (1982)] isoliert werden.
[0152] C 1.1.4. Verknüpfung von Vektor und Insertionsfragment mit T4-DNS-Ligase
[0153] 0.5 μg desphosphorylierte pSA 125-Vektor-DNS wurden m 0.5 μg des isolierten 86 Bp-Fragmentes in 100 μl Ligase-Pu fer (Lsg. B 1.3.) mit 4,5 Weiss-Einheiten [B. Weiss et al. J. Biol. Chem. 243, 4543-4555 (1968) ] T4-DNS-Ligase für Std.. bei 23 °C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dire für die Transformation kompetenter Empfängerzellen einge setzt.
[0154] C 1.2. Transformation von Escherichia coli SB 44
[0155] C 1.2.1.
[0156] 50 μl T4-Ligase-Reaktionsprodukte wurden zur Transformati von kompetenten E.coli SB 44-Zellen unter den bei M. Dage und S.D. Ehrlich [Gene 6_, 23-28 (1979)] beschriebenen Bedi gungen eingesetzt.
[0157] C 1.2.2. Selektion von Transformanten
[0158] Bei Einbau in die gewünschte Pstl-Schnittstelle in Positi 1624 des Vektors bleibt die Ampicillin-Resistenz erhalte Das Transformationgsgemisch wurde deshalb auf LB-Agar [T. M niatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in: 'Molecular Cloning' S. 440, Cold Spring Harbor Lab., New York (1982)] ausplat tiert, der 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Von 220 Transfo mantenkolonien wurden 12 Klone für die Isolierung von Plas mid-DNS ausgewählt.
[0159] ERSATZBLATT C 1.3. Charakterisierung von Transformanten durch Größen¬ bestimmungen von DNS-Fragmenten nach Umsetzung mi speziellen Restriktionsendonukleasen
[0160] Die Plasmidisolierung aus 12 zufällig ausgewählten Klonen er folgte gemäß Standardbedingungen [vgl. A 1.]. Durch Rückver dauung mit PstI ließ sich der Einbau des 86 Bp-Fragmentes i allen Fällen sichern.
[0161] C 1.3.1.
[0162] 5 μg DNS wurden in 100 μl 'Medium buffer' (Lsg. 1.1.) mit Einheiten PstI [Boehringer/Mannheim] für 2 Std. bei 37 °C in kubiert. Nach Extraktion mit 100 μl TE-gesättigten Phenol und 300 μl Äther wurde 0^'.3 M an Na-Acetat gemacht und die DN mit 3 Volumina Äthanol für 20 min bei -80 °C ausgefällt. Nac
[0163] Sedimentation gemäß 1.1.1. ließ sich das gesuchte Fragment i einem 4 % NuSieve TM-Agarose-Gel [Marine Colloids, Rockland
[0164] ME, USA] in 'TBE-Puffer (Lsg. B 3.1.) gelelektrophoretisc abtrennen und nach Anfärben mit Ethidiumbromid identifizie ren.
[0165] C 1.3.2.
[0166] Durch Doppelverdauung der Plasmid-DNS mit EcoRI und Ncol un nachfolgende Größenbestimmung der resultierenden Fragment ließen sich Klone identifizieren, die das ACTH 1-24 in de gewünschten Orientierung enthalten:
[0167] 5 μg DNS wurden in 100 μl 'High buffer' (Lsg. B 1.1.) mit j 10 Einheiten EcoRI und Ncol [BioLabs, vgl. S. 9] für 2 Std bei 37 °C inkubiert und, wie in C 1.3.1. beschrieben, extra hiert und äthanolgefällt. Das Produkt-Gemisch wurde mittel Elektrophorese in einem 5 % Polyacrylamidgel in 'TBE-Puffer (Lsg. B 3.1.) aufgetrennt und das Trennergebnis nach Anfärbe mit Ethidiumbromid visuell ausgewertet. Klone, die das ACTH 1-24-Insertionsfragment in der gewünsc ten pho-A-Transkriptionsrichtung eingebaut enthalten, weis Fragmente von
[0168] 96, 232, 235 und 5981 Basenpaaren auf.
[0169] jEst der Gegenstrang in entsprechender Weise integriert, s findet man die Fragmentgrößen
[0170] 96, 235, 282 und 5931 Basenpaare.
[0171] 5 Testklone zeigten das für korrekten Einbau typische Bande muster.
[0172] C 1.3.3. Bestätigung für die vollständige Integration des
[0173] 86 Bp ACTH 1-24-Genfragmentes durch DNS-Sequenzie rung
[0174] Je 3 Testklone mit integriertem 86 Bp-Pstl-DNS-Frag ent i beiden möglichen Orientierungen wurden, wie in C 1.1.3. b schrieben, mit PstI umgesetzt und die Pstl-Insertionsfragme te isoliert. Nach Reklonierung in den M13-Phagen mpl8 wur unter Standardbedingungen sequenziert [vgl. A 2.].
[0175] Einer der Transformantenklone, die nach C 1.3. das ACTH 1-24 Genfragment vollständig und in phoA-Transkriptionsrichtu eingebaut enthalten, wurde unter der Bezeichnung SB 44 (p 172) für die nachfolgende Protein-Analytik weiterkultiviert.
[0176] [vgl. Abb 3, pSA 172]
[0177] C 2. Herstellung des Expressionsklons E.coli SB 44 (pSA 186)
[0178] Dieser Klon synthetisiert ein Fusionsprotein, das aus d N-terminalen Aminosäuren 1-446 des Präpeptids der alkalisch Phosphatase [M. Simonis, Dissertation Freie Universität Be lin, Berlin (1983) ], gefolgt von der Collagenaseseque -Pro-Ala-Gly-Pro- und der ACTH-Sequenz (SA 186 ) besteht :
[0179] Alk . Phosphatase ( 1-446 ) -Pro-Ala-Gly-Pro-ACTH i 1
[0180] Kollagenase- Erkennungs- SA 186 Sequenz
[0181] C 2.1. Integration eines 131 Bp Pstl-Restriktionsfragment mit Codons für ACTH in die Pst/Schnittstelle i Position 1624 des phoA-Plasmids pSA 125 (vgl. Abb. 1 )
[0182] C 2.1.1. Herstellung des linearen Vektorplasmids
[0183] (wie in C 1.1.1. beschrieben)
[0184] C 2.1.2. Dehosphorylierung des linearen Vektorplasmids
[0185] (wie in C 1.1.2. beschrieben)
[0186] C 2.1.3. Herstellung des ACTH-DNS-Insertionsfragmentes
[0187] Ein 131 Bp-DNS-Fragment mit Pstl-Erkennungssequenzen an bei den Enden, das die Codons für ACTH enthält [vgl. Abb. 4a ACTH-Sequenz], wurde aus dem Plasmid pSA 504 [hinterlegt al E.coli HB 101 (pSA 504) - DSM 4192] .
[0188] [vgl. Abb. 4, pSA 504]
[0189] 50 μg pSA 504-DNS wurden unter den in C 1.1.3. beschrieben Bedingungen mit PstI umgesetzt. Gemäß C 1.1.3. ließ sich au das benötigte 131 Bp-Pstl-Fragment erhalten. C 2.1.4. Verknüpfung von Vektor und Insertionsfragment mit T4-DNS-Ligase
[0190] 0.5 μg des isolierten 131 Bp-Fragmentes wurden nach den in 1.1.4. beschriebenen Bedingungen mit der Vektor-DNS verknüpf
[0191] C 2.2. Transformation von Escherichia coli SB 44
[0192] 50 μl des Ligase-Ansatzes wurden, wie unter C 1.2. beschrie ben, eingesetzt.
[0193] C 2.2.1. Selektion von Transformanten
[0194] Die unter C 1.2.1. beschriebene Selektion auf A picillin-LB Agarplatten konnte auch hier angewandt werden. Von 180 Trans formantenkolonien wurden 12 Klone für die Isolierung vo Plasmid-DNS ausgewählt.
[0195] C 2.3. Charakterisierung von Transformanten durch Größen¬ bestimmung nach Umsetzung mit speziellen Restrik tionsendonukleasen
[0196] C 2.3.1.
[0197] Der Nachweis des 131 Bp-Fragment-Einbaus durch Rückverdauun mit PstI und gelelektrophoretischer Analyse erfolgte gem. C 1.3.1. mit je 5 μg Plasmid-DNS aus den 12 Testklonen.
[0198] C 2.3.2.
[0199] Die Bestimmung der Einbaurichtung wurde unter gleichen Bedin gungen, wie in C 1.3.2. beschrieben, mit je 5 μg DNS^' vorge nommen.
[0200] Klone, die das ACTH-Insertionsfragment in der gewünschte phoA-Transkriptionsrichtung eingebaut enthalten, weisen Frag mente von
[0201] 96, 232, 235 und 6026 Basenpaaren auf. Ist der Gegenstrang in entsprechender Weise integriert, s findet man die Fragmentgrößen
[0202] 96, 235, 327 und 5931 Basenpaare.
[0203] 4 Testklone zeigten das für korrekten Einbau typische Banden muster.
[0204] C 2.3.3. Bestätigung für die vollständige Integration des 131 Bp-ACTH-Genfragmentes durch DNS-Sequenzierung
[0205] Die 4 in C 2.3.2. beschriebenen Testklone sowie 2 Klone mi gegenläufiger Einbau-Orientierung wurden gem. C 1.3.3. i Ml3mpl8 subkloniert und sequenziert.
[0206] Einer der Transformantenklone, die nach C 2.3. das ACTH-Gen fragment vollständig und in phoA-Transkriptionsrichtung ein gebaut enthalten, wurde unter der Bezeichnung SB 44 (pSA 186 für die nachfolgende Protein-Analytik weiterkultiviert.
[0207] [vgl. Abb. 5, pSA 186]
[0208] C 3. Herstellung des Expressionsklons SB44 (pSA 341)
[0209] Dieser Klon synthetisiert ein Fusionsprotein, das aus de N-terminalen Aminosäuren 1-444 des Präpeptids der alkalische Phosphatase [M. Simonis, Dissertation Freie Universität Ber lin, Berlin (1983) ], gefolgt von Glycin und 5 Kollagenaseer kennungsSequenzen vor der ACTH-Sequenz (SA 341) besteht:
[0210] Alk.Phosphatase (1-444) -Gly-Pro-His-Gly- (Pro-Ala-Gly) ,-Pro- A
[0211] 5 Kollagenase-Erkennungssequenzen SA 341
[0212] ERSATZBLATT C 3.1. Ein- oder mehrfache Integration von 131 Bp-Pstl-Re striktionsfragmenten mit Codons für ACTH in die Pstl-Schnittstelle in Position 1657 des Vektorplas mids pSA 506
[0213] ⁽vg^l. H. Scheidecker et al. , Deutsche Patentanmeldung Akten zeichen P 37 31 875.6 und A_bb. ₆. )
[0214] C 3.1.1. Herstellung des linearen Vektorplasmids
[0215] 1 μg pSA 506-DNS (hergestellt nach P 37 31 875.6) wurde wie in C 1.1.1. beschrieben mit 0.2
[0216] Einheiten PstI [Boehringer/Mannheim! bei 37 °C für 5 Min partiell verdaut und das Gemisch an linearen 6499-Bp-Fragmen ten nach elektrophoretischer Auftrennung in einem 0.8 % Aga rose-Gel gem. C 1.1.1. isoliert.
[0217] C 3.1.2. Herstellung des ACTH-DNS-Insertionsfragments
[0218] (wie in C 2.1.3. beschrieben)
[0219] C 3.1.3. Verknüpfung von Vektor und Insertionsfrag ent mit T4-DNS-Ligase
[0220] 0.1 μg Pstl-linearisierte pSA506-Vektor-DNS wurden mit 0.1 μ des isolierten 131 Bp-ACTH-Fragmentes in 50 μl Ligase-Puffe (B Lsg. 1.3.) mit 1 Weiss-Einheit [B. Weiss et al., J. Biol Chem. _24_3__/ 4543-4555 (1968) ] T4-DNS-Ligase [Boehringer/Mann heim] über Nacht bei 9 °C inkubiert.
[0221] C 3.2. Transformation von Escherichia coli SB 44
[0222] C 3.2.1.
[0223] Das gesamte Ligase-Reaktionsgemisch wurde zur Transformatio von kompetenten E.coli SB 44-Zellen, wie unter 1.2.1. refe riert, eingesetzt.
[0224] ERSATZBLATT 3.2.2. Selektion von Transformationen
[0225] Auf LB-Agar [T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in 'Molecular Cloning', S. 440ff, Cold Spring Harbor Lab., Ne York (1982) ] mit 100 μg/ml A picillingehalt wurden ca. 800 resistente Klone erhalten.
[0226] C 3.3. Charakterisierung von Transformanten
[0227] Wegen der symmetrischen Pstl-Enden von Vektor und Insertion fragment war von unterschiedlichen Einbauorientierungen au zugehen. Außerdem waren Klone mit wiederholt integriert 131 Bp-Fragmenten oder teilweise deletierter Mehrfach-Koll genase-Erkennungssequenz zu erwarten, und darüberhinaus sta den im Vektorgemisch mit den Sequenzpositionen 1630 u 1657 Bp [vgl. Abb. 6] zwei konkurrierende Integrationsor zur Verfügung. Die Charakterisierung des entsprechend ko plexen Transformantenspektrums mußte deshalb in mehrer Schritten erfolgen.
[0228] C 3.3.1. Identifizierung von Klonen, die ACTH-Gensequenzen enthalten
[0229] Hierzu wurden 700 Klone auf LB-Agar [T. Maniatis, E.F.Frits und J. Sambrook in: 'Molecular Cloning', S. 440, Cold Spri Harbor Lab., New York (1982) ] mit 50 μg/ml Ampicillin übe impft und auf Whatman 540-Filter übertragen. Die Identifizi rung erfolgte nach einem von R.B. Wallace et al. [Nucl. A Res. 9_, 879-894 (1982) ] sowie J.P. Gergen et al. [Nucl. A Res. _8_, 2115-2136 (1979) ] beschriebenen Hybridisierungsve fahren. Als spezifische Hybridisierungsprobe konnte e 15 Bp-Oligonukleotid benutzt werden, das zur Herstellung d ACTH-Plasmids pSA 504 eingesetzt worden war [Handelspräpar der Fa. Applied Biosystems, 6108 Weiterstadt] . Es besitzt d Sequenz:
[0230] CTTCTTGCCCACCGG-3
[0231] ERSAT - 29 -
[0232] 0.6 αg des Nukleotids wurden nach M.D. Edge et al. [Nature 292, 756-762 (1981) ] mit 20 μCi [ ^-³²P] ATP [Fa. Amersham
[0233] Buchler1 und 1 Einheit T4-Polynukleotidkinase phophoryliert und damit radioaktiv markiert. Die Abtrennung des 32P-pho- sphorylierten Produktes erfolgte nach K.-M. Lo et al. [Proc.
[0234] Natl. Acad. Sei jTl, 2285-2289 (1984) ] mittels einer SEP-Pak
[0235] TM C 18 -Einmal-Säule [Fa. Waters GmbH, 6240 Königstein/Ts. ] .
[0236] 280 Klone zeigten ein positives Hybridisierungssignal mit der
[0237] P-Probe.
[0238] C 3.3.2. Identifizierung von Klonen, die Codons für 5 Kolla- genaseerkennungssequenzen enthalten
[0239] Dieser Test wurde ebenfalls nach dem in 3.3.1. beschriebenen Kolonie-Hybridisierungsverfahren mit einer radioaktiv mar¬ kierten 45 Basen-Oligonukleotidprobe durchgeführt, die zur Herstellung des Vektorplasmids pSA 506 [Abb. 6 und Deutsche Patentanmeldung, Aktenzeichen P3731875.6 ^~~ unter Stan¬ dardbedingungen [vgl. A 3.3 synthetisiert worden war.
[0240] 5 '-CGGACCTGCAGGGCCTGCTGGACCCGCCGGGCCTGCAGGACCATG-3 ' zu pSA 341 komplementärer Bereich
[0241] Das 3 '-Ende dieses Oligonukleotids ist über einen Bereich vo 41 Basen (90 %) komplementär, zu dem Genabschnitt im Informa tionsstrang des Plas ids pSA 341 [Abb. 7], der für die 5 auf einanderfolgenden Kollagenase-Erkennungssequenzen im Fusions protein [vgl. C 3.] codiert. tu
[0242] Von 100 zufällig ausgewählten Klonen, die nach C 3.3.1. ACTH Insertionen enthielten, zeigten 35 positive Hybridisierungs signale mit dem für die Mehrfach-Kollagenase-Erkennungsse quenz spezifischen Oligonukleotid (s. oben) . C 3.3.3. Charakterisierung von Transformanten durch Größen¬ bestimmung von DNS-Fragmenten nach Umsetzung mi speziellen Restriktionsendonukleasen
[0243] Die Plasmidisolierung aus 16 nach dem Zufallsprinzip ausge wählten Klonen entsprechend dem Ergebnis von 3.3.2. erfolgt gemäß Standardbedingungen [vgl. A I.].
[0244] C 3.3.3.1. Bestimmung der Anzahl eingebauter 131 Bp-ACTH
[0245] Fragmente
[0246] 5 μg DNS wurden mit 20 Einheiten EcoRI [BioLabs, vgl. S. 10 und 10 Einheiten SphI [Boehringer/Mannheim] wie in C 1.3.2 beschrieben, umgesetzt, die Produkte gelelektrophoretisc aufgetrennt und das Resultat visuell ausgewertet.
[0247] C 3.3.3.2. Bestimmung der Einbau-Orientierung für das
[0248] 131 Bp-ACTH-Fragment
[0249] 5 μg DNS wurden mit 7 Einheiten Ncol [BioLabs, vgl. S. 1 und 3 Einheiten SphI [Boehringer/Mannheim], wie in C 1.3. beschrieben, umgesetzt, die Produkte gelelektrophoretis aufgetrennt und das Resultat visuell ausgewertet.
[0250] C 3.3.3.3. Identifizierung von Klonen, deren Insertion der Pstl-Schnittstellenposition 1657, d. ' stromabwärts ' zum Fünffach-Kollagenase-Ge fragment erfolgt ist
[0251] 10 μg DNS wurden mit 18 Einheiten Hinfl [BioLabs, vgl. S. 1 in 90 μl 'Medium buffer' (Lsg. B 1.1.) für 2 Std. bei 37 verdaut. Danach v/urden 10 μl 0.41 M Tris/HCl pH 7.5 + 0.55 NaCl + 18 Einheiten Ncol [BioLabs, vgl. S. 10] zugesetzt u weitere 2 Std. bei 37 °C inkubiert. Aufarbeitung und Auswe tung des Tests erfolgten wieder gemäß C 1.3.2. Durch vergleichende Analyse der nach C 3.3.3.1, C 3.3.3.2 und C 3.3.3.3. erhaltenen Befunde ließ sich ein Rekombinan tenklon identifizieren, dessen Gel-Bandenmuster der Struktu des Plasmids pSA 341 [Abb. 7] entsprach.
[0252] C 3.3.4. Strukturbestätigung durch DNS-Sequenzierung
[0253] Aus der DNS-Umsetzung nach C 3.3.3.1. ließ sich ein 519 Bp EcoRI/ Sphl-Restriktionsfragment, wie in C 1.1.3. beschrie ben, isolieren und Aliquots davon in die Phagen M13mpl8 un Ml3mpl9 subklonieren. Unter Verwendung geeigneter Polymeras I-Primer konnte unter Standard-Sequenzierungsbedingunge [vgl. A 2.] die Identität des Klons SB 44 (pSA 341) mit de tandemförmigen Integration von zwei 131 Bp-ACTH-DNS-Fragmen ten in die Pstl-Schnittstelle an Position 1657 des Vektor pSA 506 bestätigt werden.
[0254] [vgl. Abb. 7, pSA 341]
[0255] C 3.3.5. Andere Expressionsklone aus dem für das Plasmid pSA 341 angegebenen Klonierungsverfahren
[0256] Unter den restlichen 15 Plasmidisolaten aus C 3.3.3. ließe sich mittels der dort beschriebenen verschiedenen Analyse schritte 2 weitere Klone identifizieren, die für die ACTH Herstellung geeignete Fusionsproteine exprimieren.
[0257] C .4. Eigenschaften des Expressionsklons' SB 44 (pSA 343)
[0258] Dieser Klon, synthetisiert ein Fusionsprotein, das aus de N-terminalen Aminosäuren 1-444 des Präpeptids der alkalische Phosphatase [M. Simonis, Dissertation Freie Universität Ber lin, Berlin (1983) ], gefolgt von Glycin und 2 Kollagenase-Er kennungssequenzen vor der ACTH-Sequenz (SA 343) , besteht:
[0259] Alk. Phosphatase (1-444) -Gly-Pro-His-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-ACT
[0260] 2 Kollagenase-Erkennungs- SA 343 Sequenzen Aus den analytischen Daten [vgl. C 3.] ergab sich, daß ei
[0261] 131 Bp-Pstl-Restriktionsfragment mit den Codons für ACTH i die Pstl-Schnittstelle in Position 1630 des Vektorplasmid pSA 506 [vgl. Abb. 6] integriert wurde.
[0262] [vgl. Abb. 8, pSA 343]
[0263] C 5. Eigenschaften des Expressionsklons SB 44 (pSA 345)
[0264] Dieser Klon synthetisiert ein Fusionsprotein, das mit dem v SB 44 (pSA 341) exprimierten Produkt identisch ist [vg C 3. ].
[0265] Aus den analytischen Daten ergibt sich, daß ein 131 Bp-Pst Restriktionsfragment mit den Codons für ACTH in die Pst Schnittstelle in Position 1657 des Vektorplasmids pSA 5 [vgl. Abb. 6] ' integriert wurde.
[0266] [vgl. Abb. 9, pSA 345]
[0267] C 6. Herstellung des Expressionsklons SB 44 (pSA 353)
[0268] Dieser Klon synthetisiert ein Fusionsprotein, das aus d Aminosäuren 1-444 des Präpeptids der alkalischen Phosphata [M. Simonis, Dissertation Freie Universität Berlin, Berl (1983) ], gefolgt von Glycin und 5 Kollagenase-Erkennungss quenzen vor der ACTH 1-24-Sequenz (SA 353) , besteht:
[0269] Alk.Fhosphatase(l-444)-Gly-Pro-His-Gly-(Pro-Ala-Gly) -Pro-ACTHl-24
[0270] 4 l I
[0271] 5 Kollagenase-Erkennungs- sequeπzen SA 353 C 6.1. Integration eines 86 Bp-Pstl-Restriktionsfragmente mit Codons für ACTH 1-24 in die Pstl-Schnittstell in Position 1657 des Vektorplasmids pSA 506
[0272] C 6.1.1. Herstellung des linearen Vektorplasmids
[0273] (wie in C 3.1.1. beschrieben)
[0274] C 6.1.2. Herstellung des ACTH 1-24-DNS-Insertionsfragmentes
[0275] (wie in C 1.1.3. beschrieben)
[0276] C 6.1.3. Verknüpfung von Vektor und Insertionsfrag ent mit T4-DNS-Ligase
[0277] 0.1 μg Pstl-linearisierte pSA 506-Vektor-DNS wurden mi 0.1 μg des isolierten 86 Bp-ACTH 1-24-Fragmentes unter den i C 3.1.3. beschriebenen Bedingungen umgesetzt.
[0278] C 6.2. Transformation von Escherichia coli SB 44
[0279] C 6.2.1.
[0280] (wie in C 3.2.1. beschrieben)
[0281] C 6.2.2. Selektion von Transformanten
[0282] Durchführung wie in C 3.2.2. beschrieben. Es wurden ca. 600 Ampicillin-resistente Klone erhalten.
[0283] C 6.3. Charakterisierung von Transformanten
[0284] (vgl. Kommentar zu C 3.3) C 6.3.1. Identifizierung von Klonen, die ACTH-Gensequenzen enthalten
[0285] Wie in C 3.3.1. beschrieben. 315 Klone zeigten ein positive HybridisierungsSignal mit der [ 32P]-Probe.
[0286] C 6.3.2. Identifizierung von Klonen, die Codons für 5 Kolla genase-Erkennungssequenzen enthalten
[0287] Wie in C 3.3.2. beschrieben. Es wurden 41 Klone erhalten, di mit dem für die Mehrfach-Kollagenase-Erkennungssequenz spezi fischen Oligonukleotid [vgl. C 3.3.2.] unter stringenten Be dingungen (15 Minuten, 50 °C, 50 % Formamid) hybridisierten.
[0288] C 6.3.3. Charakterisierung von Transformanten durch Größen¬ bestimmung von DNS-Fragmenten nach Umsetzung mi speziellen Restriktionsendonukleasen
[0289] Wie in C 3.3.3. beschrieben. Duch vergleichende Analyse de wie in C 3.3.3.1. - C 3.3.3.3. erzielten Befunde ließ sic ein Rekombinationsklon identifizieren, dessen Gel Banden muster der Struktur des Plasmids pSA 353 (Abb. 10) entsprach
[0290] C 6.3.4. Strukturbestätigung durch DNS-Sequenzierung
[0291] Wie in C 3.3.4. beschrieben. Der Einbau des 86 Bp-ACTH 1-24 DNS-Fragmentes in die Pstl-Schnittstelle an Position 1657 d Vektors pSA 506 ließ sich bestätigen.
[0292] [vgl. Abb. 10, pSA 353]
[0293] C 7. Herstellung des Expressionsklons SB 44 (pSA 509)
[0294] Dieser Klon synthetisiert ein Fusionsprotein, das aus d N-terminalen Aminosäuren 1-444 des Präpeptids der alkalisch Phosphatase [M. Simonis, Dissertation Freie Universität Be lin, Berlin (1982) ], gefolgt von Glycin und 5 Kollagenase-E
[0295] ERSAT kennungssequenzen vor der ACTH-Sequenz (SA 509) , besteht:
[0296] Alk..Phosphaεase^('l-444)-Gly-Pro-His-Gly-(Pro-Ala-Gly) -Pro-lyr-Gly-Pro-ACTH u l
[0297] 5 ollagenase-Erkennungssequeπzeπ
[0298] SA 509
[0299] C 7.1. Integration eines 158 Bp-Pstl-Fragmentes mit Codons für 3 1/2 Kollagenaseschnittstellen vor ACTH in die Pstl-Schnittstelle in Position 1630 des Vektorplas¬ mids pHS 4133
[0300] [vgl. Deutsche Patentanmeldung Aktenzeichen P 37 31 875.63
[0301] C 7.1.1. Herstellung des linearen Vektorplasmids 6.7 μg pHS 133-DNS (hergestellt nach P 37 31 875.6) wurden in 60 μl 'Medium buffer' (Lsg. B 1.1. ) mit 2,4 Einheiten PstI (Boehringer/Mannheim) für 1 Std. bei 37 °C partiell verdaut. Die weitere Aufarbeitung des An¬ satzes und die gelelektrophoretische Isolierung des linearen 6473 Bp-DNS-Gemisches erfolgte gemäß C 1.1.1.
[0302] C 7.1.2. Dephosphorylierung des linearen Vektorplasmids
[0303] Die DNS wurde in 26 μl TE-Puffer (Lsg. B 2.) gelöst und in 30 μl Reaktionsvolumen, wie in C 1.1.2. beschrieben, dephos- phoryliert und aufgearbeitet.
[0304] C 7.1.3. Herstellung des ACTH-DNS-Insertionsfragmentes
[0305] Dieses Fragment ließ sich durch Ligase-Verknüpfung eines Sub- fragmentes aus pSA 186 [vgl. Abb. 5] mit 2 synthetisch herge¬ stellten Oligonukleotiden gewinnen. C 7.1.3.1. Herstellung eines 113 Bp-DNS-Fragmentes aus pSA 186 mit Partialsequenzen für ACTH
[0306] 90 μg pSA 186 wurden in 180 μl 'Medium buffer' (Lsg. B 1.1.) mit 300 Einheiten PstI [Boehringer/Mannheim] für 2 1/2 Std. bei 37 °C verdaut. Danach wurden 120 μl 0.11 M Tris/HCl pH 7.5 + 0.175 M NaCl + 60 Einheiten Ncol [BioLabs, vgl. S. 10] zugesetzt und weitere 2 1/2 Std. bei 37 °C inkubiert. Nach Extraktion mit 300 μl TE-gesättigten Phenols und zweima¬ liger Extraktion mit je 600 μl Äther wurde 0.2 M an Na-Äcetat ^"gemacht, die DNS über Nacht bei -25 °C ausgefällt und gem. C 1.1.1. sedimentiert. Nach Lösen in 16 μl TE-Puffer wurde das Produktgemisch mittels Gelelektrophorese in 6 % Polyacry- lamid in TBE-Puffer (Lsg. B 3.1.) aufgetrennt und das 113 Bp- Pstl/Ncol-Restriktionsfragment gem. C 1.1.1. isoliert.
[0307] C 7.1.3.2. Herstellung von zwei Oligonukleotiden zur Er¬ gänzung des nach 7.1.3.1. hergestellten ACTH- Teilfragmentes
[0308] Die beiden Oligonukleotide sind zueinander komplementär und bilden unter geeigneten Bedingungen ein 45 Bp-Pstl/Ncol-Hy- brid aus. Unter Standardbedingungen synthetisiert und aufge¬ arbeitet [vgl. A 3.]wurden das 41 Basen-Nukleotid
[0309] 5 '-GGCCCGGCGGGTCCAGCAGGCCCTTATGGACCTAGCTACTC-3 '
[0310] und das 49 Basen-Nukleotid
[0311] 5 ' -CATGGAGTAGCTAGGTCCATAAGGGCCTGCTGGACCCGCCGGGCCTGCA-3 ' .
[0312] Beide Oligonukleotide wurden am 5 '-Ende phosphoryliert:
[0313] Je 2.7 μg des 41-Basen- bzw. 3.3. μg des 49-Basen-Nukleotid wurden in je 20 μl Reaktionsvolumen in Kinase-Puffer (Lsg B 1.4.) mit jeweils 10 Einheiten Pol nukleotid-Kinase [Phar macia/P-L, vgl. S. 10] für 1 Std. bei 37 °C inkubiert. Di Reaktionen wurden durch jeweils 10 Min. Inaktivierung des En zyms bei 65 °C gestoppt.
[0314] C 7.1.3.3. Verknüpfung der nach C 7.1.3.1. und C 7.1.3.2 erhaltenen Produkte mittels T4-DNS-Ligase
[0315] Die inaktivierten Kinase-Produktgemische wurden vereinigt mit 10 μl lOfach konzentriertem Ligase-Puffer (Lsg. B 1.3. lOx konzentriert) , 1 μg 113 Bp-DNS-Fragment aus C 7.1.3.1 und H^O zu 92 μl ergänzt und auf 50 °C temperiert. Nac 30 Min. Abkühlung auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsvolu men durch Zusatz von 48 Weiss-Einheiten [B. Weiss et al., J Biol. Chem. 2 A3_, 4543- 4555, (1968) ] zu 100 μl komplettier und über Nacht bei 13 °C inkubiert. Abschließend wurde mi 100 μl TE-gesättigten Phenols und zweimal 200 μl Äther extra hiert und wie in C 7.1.3.1. äthanolgefällt und aufgearbeitet
[0316] C 7.1.3.4. Prozessieren von Oligomerprodukten durch
[0317] Nachverdauung mit PstI
[0318] Die Ligase-Produkte wurden in 100 μl 'Medium buffer' (Lsg. 1.1.) mit 9 Einheiten PstI [Boehringer/Mannheim] für 3 Std bei 37 °C inkubiert und erneut gem. C 7.1.3.3. aufgearbeitet
[0319] C 7.1.3.5. Isolierung des 158 Bp-Pstl-DNS-Fragmentes mit
[0320] Codons für 3 1/2 Kollagenase-ErkennungsSequen zen vor ACTH
[0321] Das Gemisch der Pstl-nachverdauten Ligaseprodukte wurde i 16 μl _, TE-Puffer gelöst und mittels Gelelektrophorese in 10 Polyacrylamid in TBE-Puffer (Lsg. B 3.1.) aufgetrennt. Di Isolierung des gesuchten 158 Bp-Fragmentes erfolgte gem C 1.1.1. C 7.1.4. Verknüpfung von Vektor und Insertionsfragment mit T4-DNS-Ligase
[0322] 2 μg desphosphorylierte pHS 4133-Vektor-DNS 'aus C 7.1.2. wur¬ den mit 14 ng 158 Bp-Fragment in 20 μl Ligase-Puffer (Lsg. B 1.3.) mit 9 Weiss-Einheiten [B. Weiss et al., J. Biol. Chem. 243, 4543-4555 (1968) ] T4-DNS-Ligase über Nacht bei 13 °C inkubiert. Abschließend wurde gem. 7.1.3.1. mit Phenol und Äther extrahiert, äthanolgefällt und aufgearbeitet.
[0323] C 7.2. Transformation von Escherichia coli SB 44
[0324] 1/3 der Ligase-Produkte aus C 7.1.4. wurde in 50 μl TE-Puffer gelöst und zur Transformation von kompetenten E.coli SB 44- Zellen, wie in C 1.2.1. referiert, eingesetzt. Es wurden 203 Ampicillin-resistente Klone gefunden.
[0325] C 7.3. Charakterisierung von Transformanten durch Größen¬ bestimmung von DNS-Fragmenten nach Umsetzung mit PstI und Ncol
[0326] Die Plasmidisolierung aus 16 nach dem Zufallsprinzip ausge¬ wählten Klonen erfolgte unter Standardbedingungen [vgl. A I.].
[0327] C 7.3.1. Rückverdauung mit PstI
[0328] Wie in C 1.3.1. beschrieben. Es wurden 10 Klone gefunden, die das 158 Bp-Pstl-Insert besaßen.
[0329] C 7.3.2. Bestimmung der Einbauorientierung für das 158 Bp- ACTH-Fragment
[0330] Je 5 μg DNS wurden in 20 μl 'High buffer' (Lsg. B 1.1.) mit 7 Einheiten Ncol [BioLabs, vgl. S. 10] für 3 Std. bei 37 °C in¬ kubiert. Danach erfolgte die Größenbestimmung der Restrik¬ tionsfragmente nach Gelelektrophorese gem. C 1.3.2. in Gegen- wart von DNS-Größenmarkern. Klone, die das Insertionsfragment in der gewünschten phoA-Transkriptionsrichtung eingebaut ent¬ halten, weisen Fragmente von
[0331] 500 und 6130 Basenpaaren auf.
[0332] Ist der Gegenstrang in entsprechender Weise integriert, so resultieren Fragmentgrößen von
[0333] 568 und 6062 Basenpaaren.
[0334] Ein Testklon (pSA 509) zeigte das für korrekten Einbau typi¬ sche Ncol-Bandenmuster.
[0335] C 7.3.3. Strukturbestätigung durch DNS-Sequenzierung
[0336] 15 μg pSA.509 DNS wurden in 30 μl 'High buffer' (Lsg. B 1.1.-) mit 25 Einheiten SphI [Boehringer/Mannheim] und 40 Einheiten EcoRI [BioLabs, vgl. S. 10] für 5 Std. bei 37 °C inkubiert. Danach wurde das Fragmentgemisch mittels Gelelektrophorese gem. C 1.1.3. aufgetrennt und ein 388 Bp-Fragment isoliert, das den gesamten Codierungsbereich für die Kollagenase- Schnittstellen und das ACTH enthielt. Dieses Fragment wurde in die Phagen Ml3mpl8 und Ml3mpl9 subkloniert und unter Stan¬ dardbedingungen [vgl. A 2.] sequenziert.
[0337] Aus den Sequenz-Daten ließ sich die Struktur des ACTH-Expres- sionsklons pSA 509 bestätigen:
[0338] [vgl. Abb 11, pSA 509]
[0339] C 8. Herstellung des Expressionsklons SB 44 (pHS 6134)
[0340] Dieser Klon synthetisiert ein_^ Fusionsprotein, das aus den N-terminalen Aminosäuren 1-297 des Präpeptids der alkali¬ schen Phosphatase [M. Simonis, Dissertation Freie Universität Berlin, Berlin (1983) ], gefolgt von Prolin, Tryptophan und 4 Kollagenase-Erkennungssequenzen vor der ACTH-Sequen (HS 6134 ) , besteht :
[0341] ALk.Phosphatase(l-297)-Pro-Trp-(Pro-Ala-Gly) -Pro-Iyr-Gly-Pro-ACTH
[0342] 4 Kbllageπase-Erkeπnungs- sequeπzen.
[0343] HS 6134
[0344] C 8.1. Integration eines 158 Bp-Pstl-Restriktionsfragmen¬ tes mit Codons für 3 1/2 Kollagenase-Schnittstelle vor ACTH 1-39 in die Pstl-Schnittstelle in Positio 1183 des Vektorplasmids pSA 302
[0345] ^[vgl. Deutsche Patentanmeldung Aktenzeichen P 37 31 875.6]
[0346] C 8.1.1. Herstellung des linearen Vektorplasmids ₁μg p_{SA 3}0₂ (hergestellt nach P 37 31 875.6) wurde in 50 μl Reaktionsvolumen, wie in C 1.1.1. beschrieben, partiell mit PstI [Boehringer/Mannheim] verdau Das Gemisch der beiden möglichen linearen 6472-Bp-Fragmen ließ sich, ebenfalls gem. C 1.1.1., gelelektrophoretisch is lieren.
[0347] C 8.1.2. Dephosphorylierung des linearen Vektorplasmids
[0348] (wie in C 1.1.2. beschrieben)
[0349] C 8.1.3. Herstellung des 158 Bp-Pstl-Insertionsfragmentes
[0350] 50 μg pSA 509-DNS werden gemäß C 1.1.3. mit PstI verdaut u nach gelelektrophoretischer Isolierung aufgearbeitet.
[0351] C 8.1.4. Verknüpfung von Vektor und Insertionsfragment mi T4-DNS-Ligase
[0352] 0.1 μg dephosphorylierte pSA 302-Vektor-DNS wurden 0.25 μg des isolierten 158 Bp-Fragmentes in 50 μl Ligase-P fer (Lsg. B 1.3.) mit 1 Weiss-Einheit [B. Weiss et al., J. Biol. Chem. 243, 4543-4555 (1968) ] T4-DNS-Ligase [Boehringer/ Mannheim] über Nacht bei 16 °C inkubiert.
[0353] C 8.2. Transformation von Escherichia coli SB 44
[0354] C 8.2.1.
[0355] Das gesamte Ligase-Reaktionsgemisch aus C 8.1.4. wurde gem. C 1.2.1. zur Transformation kompetenter E.coli SB 44-Zellen eingesetzt.
[0356] C 8.2.2. Selektion von Transformanten
[0357] Bei Einbau in die gewünschte Pstl-Schnittstelle in Position 1183 des Vektors bleibt die Ampicillinresistenz erhalten. Die Transfor anten-Selektion konnte deshalb gem. C 1.2.2. erfol¬ gen. 15 Ampicillin-resistente Klone wurden für weitere Unter¬ suchungen ausgewählt.
[0358] C 8.3. Charakterisierung von Transformanten durch Größen¬ bestimmung von DNS-Fragmenten nach Umsetzung mit PstI und Rsal
[0359] C 8.3.1. Rückverdauung mit PstI
[0360] Wie in C 1.3.1. beschrieben. Für 10 Transformanten-Klone konnte das 158 Bp-Insert eindeutig nachgewiesen werden.
[0361] C 8.3.2. Bestimmung der Einbau-Orientierung des 158 Bp-Pstl- Insertionsfragmentes
[0362] 4 μg Plasmid-DNS wurden mit 7.5 Einheiten Rsal [BioLabs, vgl. S. 10] in 100 μl 'Medium buffer' (Lsg. B 1.1.) über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Auftrennung und visuelle Auswertung des Produktgemisches erfolgte gemäß C 1.3.2. Von den insgesamt 9 möglichen Rsa -Restriktionsfragmente sind zwei Fragmente der Längen
[0363] 97 und 114 Basenpaare
[0364] charakteristisch für einen Einbau in der gewünschten phoA Transcriptionsrichtung.
[0365] Bei entsprechender Integration des Gegenstranges findet ma stattdessen die Fragmentgrößen
[0366] ^' 68 und 143 Basenpaare.
[0367] 2 Testklone zeigten das für korrekten Einbau typische Banden muster. Sie erhielten die Bezeichnungen pHS 6134 und pHS 613
[0368] [vgl. Abb 12, pHS 6134]
[0369] C 9. Herstellung des Expressionsklons SB 44 (pSA 351)
[0370] Dieser Klon synthetisiert ein Fusionsprotein, das mit dem vo SB 44 (pHS 6134) exprimierten Produkt identisch ist [vgl C 8.1.
[0371] Das Expressionsplasmid pSA 351 enthält gegenüber dem Plasmi pHS 6134 eine Deletion von 461 Basenpaaren im nicht transla tierten DNS-Bereich zwischen dem Ochre Codon des ACTH und d Terminatorregion [vgl. Chung Nan Chang et al. , Gene 44 121-125 (1986) ] des phoA-Gens.
[0372] C 9.1. Linearisierung des Expressionsplasmids pHS 6134 (Abb. 12)
[0373] 10 μg pHS 6134-DNS wurden in 50 μl 'High buffer* (Ls B 1.1.) mit 10 Einheiten SphI [Boehringer/Mannheim] f 2 Std. bei 37 °C inkubiert, gem. C 1.1.3. mit Phenol u Äther extrahiert und äthanolgefällt. C 9.1.1. Herstellung eines linearen 6173 Bp-Pstl/Sphl-Re- striktionsfragmentes durch Deletion der Bas 1345-1795 in pHS 6134
[0374] 10 0.5 μg-Aliquots der Sphl-linearisierten DNS aus C 9. wurden in 10 x 10 μl 'Medium buffer' (Lsg. 1.1.) gelöst u mit je 0.4 Einheiten PstI [Boehringer/Mannheim] für 5 Mi bei 37 °C partiell verdaut. Nach Auftrennung der Produktg mische gemäß C 1.1.1. ließ sich das gesuchte Fragment, kont miniert mit der um 158 Bp verkürzten DNS-Bande, als Äthano sediment gewinnen.
[0375] C 9.1.2. Entfernung der ungepaarten 3 '-ständigen Basen mit tels der Exonuklease III-Aktivität in T4-DNS-Poly merase
[0376] 0.75 μg der nach C 9.1.1. isolierten DNS-Fragmente wurden 50 μl Reaktionsvolumen mit 11 Einheiten T4-DNS-Polymera [Pharmacia/P-L, 7800 Freiburg] nach Maniatis et al. [i 'Molecular Cloning', S. 395, Cold Spring Harbor Lab., N York (1982) ] für 10 Min. bei 37 °C inkubiert. Nach Inaktivi rung des Enzyms durch 5 Min.-Erhitzen auf 70 °C erfolgt Phenolextraktion, Ätherextraktion und Äthanolfällung ge C 1.1.1.
[0377] C 9.1.3. Rezirkularisierung der Reaktionsprodukte aus C 9.1.2. mit T4-DNS-Ligase
[0378] Die sedimentierten Reaktionsprodukte nach Abspaltung der gepaarten 3 '-ständigen Basen wurden in 50 μl Ligase-Puff (Lsg. B 1.3.) gelöst und mit 5 Weiss-Einheiten (B. Weiss al., J. Biol. Chem. 2Λ 2_, 4543-4555 (1968) ] T4-DNS-Liga [Boehringer/Mannheim] über Nacht bei 9 °C inkubiert. C 9.2. Transformation von Escherichia coli SB 44
[0379] C 9.2.1.
[0380] Die Ligase-Produkte nach C 9.1.3. wurden vollständig zu Transformation kompetenter Zellen von E.coli SB 44 unter de bei M. Dagert und S.D. Ehrlich [Gene 6_, 23-28 (1979) ] be schriebenen Bedingungen eingesetzt.
[0381] C 9.2.2. Selektion von Transformanten
[0382] Die DNS-behandelte Zellsuspension wurde,in 5 Aliquots aufge teilt, zur Inokulation von je 20 ml LB-Medium [T. Maniatis E.F. Fritsch und J. Sambrook in: 'Molecular Cloning', S. 440 Cold Spring Harbor Lab., New York (1982) ] mit 50 μg/ml Amp cillin eingesetzt. Nach 16 Std. Schüttelinkubation bei 37 ° wurden verdünnte Aliquots auf LB-Agar ausplattiert und na 24 Std. Inkubation bei 37 °C 6 Platten mit je 70-80 Ampici lin-resistenten Kolonien für die Charaktersisierungsexper mente ausgewählt.
[0383] C 9.3. Charakterisierung von Transformanten
[0384] C 9.3.1. Identifizierung von Transformanten mit Codons für ACTH mittels 'Kolonie-Hybridisierung'
[0385] Um eine größere Anzahl Ampicillin-resistenter Klone au testen zu können, wurde wieder die Kolonie-Hybridisierung methodik, wie in C 3.3.1. beschrieben, eingesetzt. Als sp zifische Probe wurde das 158 Bp-Pstl-Fragment aus pSA 5 [vgl. C 8.3.1.], das Codons für 3 1-/2 Kollagenase-Schnit stellen vor der ACTH-Sequenz enthält, in einer Standar 'Nick translation'-Reaktion nach T. Maniatis et al. [i 'Molecular Cloning', S. 109-112, Cold Spring Harbor Lab., N York (1982) ] radioaktiv markiert. Dazu wurden 0.2 μg des g reinigten DNS-Fragmentes in 100 μl Reaktionsvolumen unt
[0386] 32 Zusatz von 50 μCi [α- P]dATP [6000 Ci/mMol; Amersham Buc ler, vgl. S. 10] mit 5 Einheiten DNS-Polymerase I [Boehr ger/Mannheim] für 1 Std. bei 15 °C inkubiert. Nach Abstop der Reaktion in 10 M EDTA erfolgte die Abtennung des [ 32 markierten Fragmentes nach Adsorption an einer Elutip- Säule, wie in C 1.1.1. beschrieben.
[0387] Nach Durchführung des Hybridisierungsverfahrens ge C 3.3.1. zeigten 50 % der ca. 450 auf 6 Test-Agarplatten C 9.2.2.) verteilten Transformanten unter stringenten Bed gungen (55 °C, in Ggw. von 50 % Formamid) positive Hybri sierungssignale nach autoradiographischer Auswertung.
[0388] C 9.3.2. Charakterisierung von Transformanten durch Größe bestimmung von DNS-Fragmenten nach Umsetzung speziellen Restriktionsendonukleasen
[0389] Die Plasmidisolierung aus 6 nach dem Zufallsprinzip aus wählten Klonen entsprechend dem Ergebnis von C 9.3.1. erfo te nach Standardbedingungen [vgl. A I.]. Als Kontrollplas wurde pHS 6134 [vgl. C 8. und Abb. 12] unter den gleic Bedingungen mituntersucht.
[0390] C 9.3.2.1. Umsetzung mit der Restriktionsendonuklease
[0391] Rsal (Negativ-Kontrolle)
[0392] Von jedem der 7 Test- bzw. Kontrollplasmide wurden 5 μg in 100 μl 'Medium buffer' (Lsg. B 1.1.) für 2 Std. 10 Einheiten Rsal [BioLabs., vgl. S. 10] bei 37 °C inkubie mit 100 μl TE- gesättigten Phenols und 2x 200 μl Äther ext hiert und gem. C 1.3.2. äthanolgefällt und gelelektropho tisch analysiert.
[0393] Keiner der 6 Testklone zeigte die für pHS 6134 charakteris schen Genfragmente von 97 Bp und 159 Bp.
[0394] ERSAT C 9.3.2.2. Umsetzung mit der Restriktionsendonuklease
[0395] Sau3AI (Positiv-Kontrolle)
[0396] Die Reaktion wurde analog zu C 9.3.2.1. durchgeführt. Di eingesetzte Enzymaktivität betrug 15 Einheiten Sau3AI [Boeh ringer/ Mannheim] .
[0397] Alle 6 Klone zeigten das für den gesuchten Deletionsklon ty pische 458 Bp-Fragment, während das für die Kontrolle pH 6134 kennzeichnende 598 Bp-Fragment fehlte.
[0398] C 9.3.2.3. Doppelverdauung mit den Restriktionsendonukle asen Sau3AI und EcoRI
[0399] Je 5 μg DNS wurden zunächst gem. C 9.3.2.2. mit Sau3AI i 90 μl Reaktionsvolumen für 2 Std. bei 37 °C umgesetzt. Danac wurde nach Zusatz von 10 μl 0.4 M Tris/HCl pH 7.5 + 0.55 NaCl + 10 Einheiten EcoRI [Boehringer/Mannheim] weitere 2 S inkubiert und gem. C 9.3.2.1. aufgearbeitet.
[0400] Alle 6 Testklone zeigten das für den Deletionsklon typisc 294 Bp-Fragment, während das für die Kontrolle pHS 6134 nac gewiesene 434 Bp-Fragment fehlte.
[0401] C 9.3.3 Strukturbestätigung durch DNS-Sequenzierung
[0402] Das aus der DNS-Doppelverdauung nach C 9.3.2.3. resultieren 294 Bp-Fragment ließ sich gemäß C 1.1.3. isolieren und in d EcoRI/BamHI-Lücke des Phagen M13mpl8 subklonieren. Unt Standard-Sequenzierungsbedingungen [vgl. A 2.] konnte dana die Identität des pHS 6134-Deletionsderivates voll bestäti werden. Der neue Klon erhielt die Bezeichnung pSA 351.
[0403] [vgl. Abb 13, pSA 351] C 10. Herstellung des Expressionsklons SB 44 (pSA 360)
[0404] Dieser Klon synthetisiert ein Fusionsprotein, das aus de N-terminalen Aminosäuren 1-444 des Präpeptids der alkalische Phosphatase [M. Simonis, Dissertation Freie Universität Ber lin, Berlin (1983) ], gefolgt von Glycin und 8 Kollagenase-Er kennungssequenzen vor der ACTH-Sequenz (SA 360) , besteht:
[0405] Alk.Phosphatase(l-444)-Gly-Pro-His-Gly-(Pro-Ala-Gly),-Pro-Iyτ-Gly-Pro-ACTH
[0406] I t i
[0407] 8 Kollagenase-Erketmungssequenzeti
[0408] SA 360
[0409] C 10.1. Herstellung des Vektorplasmids pSA 510
[0410] Dieses Plasmid unterscheidet sich von pSA 506 [vgl. Abb. lediglich durch einen T/A—> C/G Basenaustausch in Positi 1629, wodurch die entsprechende Pstl-Erkennungssequenz a pSA 506 fehlt.
[0411] [vgl. Abb. 14, pSA 510]
[0412] Die Herstellung von pSA 510 erfolgte auf dem_ gleichen We wie er für pSA 506 beschrieben wurde [s. Deutsches Akten¬ zeichen P 37 31 875.6]. Zur Insertion in die Sp I-Schnitt¬ stelle des Basis-Vektors pSB 94 (hergestellt nach P 37 31 875.6) wurden demgemäß zwei 5-Basennukleotide mit entsprechend modifizierter Sequenz unter Standardbedingung synthetisiert [vgl. A 3]:
[0413] 5 ' -GTCCGGCAGGCCCGGCGGGTCCAGCAGGCCCTGCAGGTCCGCATü-J ' und
[0414] 5 '-CGGACCTGCAGGGCCTGCTGGACCCGCCGGGCCTGCCGGACCATG-3' . C 10.2. Integration eines 158 Bp-Pstl-Fragmentes mit Codons für 3 1/2 Kollagenase-Schnittstellen vor ACTH in die Pstl-Schnittstelle in Position 1657 des Vektor¬ plasmids pSA 510
[0415] C 10.2.1. Herstellung des linearen Vektorplasmids
[0416] 0.7 μg pSA 510-DNS wurden, wie in C 1.1.1. beschrieben, mit 0.6 Einheiten PstI [Boehringer/Mannheim] bei 37 °C für 5 Min. partiell verdaut und die Reaktionsprodukte, einschließlich der beiden 6499 Bp-Pstl-Fragmente, gem. C 1.1.1. aufgearbei¬ tet.
[0417] C 10.2.2. Herstellung des 158 Bp-Pstl-Integrationsfragmentes
[0418] Das benötigte Fragment wurde aus 50 μg pHS 6134 gemäß C 1.1.3 durch Pstl-Verdauung und nachfolgende Aufarbeitung isoliert.
[0419] C 10.2.3. Verknüpfung von Vektor und Insertionsfragment mit T4-DNS-Ligase
[0420] I μg Pstl-linearisiertes pSA 510-Fragmentgemisch aus C 10.2. wurde mit 0.1 μg 158 Bp-Fragment gemäß C 3.1.3. mit T4-DNS Ligase bei 9 °C inkubiert.
[0421] C 10.3. Transformation von Escherichia coli SB 44
[0422] C 10.3.1.
[0423] 1/5 des Ligase-Reaktionsgemisches wurde zur Transformatio von kompetenten E.coli SB 44-Zellen, wie unter C 1.2.1. refe riert, eingesetzt.
[0424] C 10.3.2. Selektion von Transformanten
[0425] Auf LB-Agar [T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in 'Molecular Cloning', S. 440ff, Cold Spring Harbor Lab., Ne
[0426] * York (1982) ] mit 100 μg/ml Ampicillingehalt wurden 70 Ampi- cillin-resistente Transfor antenklone isoliert.
[0427] C 10.4. Charakterisierung von Transformanten
[0428] C 10.4.1. Identifizierung von Transformanten mit Codons für ACTH mittels 'Kolonie-Hybridisierung*
[0429] Das Verfahren wird in C 3.3.1. beschrieben. Als spezifische
[0430] Probe wurden wieder 0.75 μg des 158 Bp-Pstl-Fragmentes aus pHS 6134 benutzt. Die [ 32P]-Phosphorylierung und Aufarbeitung erfolgte nach der bereits unter C 9.3.1. beschriebenen Me- thode mit 100 μCi [ - 32P]dATP. Als Vergleichskontrollen wur¬ den Kolonien der Klone SB 44 (pSA 510) , SB 44 (pHS 6134) und HB 101 (pSB 94) [vgl. Deutsche Patentanmeldung, Aktenzeiche P 3731875.6 _ψ Abb. 2] in den Test einbezogen.
[0431] Unter stringenten Waschbedingungen (60 °C, 50 % Formamid) zeigten 21 Klone positive Hybridisierungssignale nach 16 Std. Autoradiographie bei -70 °C.
[0432] C 10.4.2. Charakterisierung von Transformanten durch Größen¬ bestimmung von DNS-Fragmenten mit PstI und Ncol
[0433] Die Plasmidisolierung aus 16 nach dem Zufallsprinzip ausge¬ wählten Klonen entsprechend dem Ergebnis von C 10.4.1. er¬ folgte unter Standardbedingungen [vgl. A I.].
[0434] C 10.4.2.1. Verdauung mit der Restriktionsendonαklease
[0435] PstI
[0436] Dieser Versuch ist unter C 1.2.1. beschrieben. 11 Klone zeig¬ ten das erwartete Bandenmuster von 158, 2441 und 4058 Bp- Fragmentlängen.
[0437] ER / 88/00536
[0438] - 50 -
[0439] C 10.4.2.2. Bestimmung der Einbau-Orientierung für das
[0440] Integratiσnsfragment durch Umsetzung mit der Restriktionsendonuklease Ncol
[0441] Dieser Versuch wurde unter C 7.3.2. beschrieben. Klone, die das 158 Bp-Pstl-Fragment in der gewünschten phoA-Transkrip- tionsrichtung eingebaut enthalten, weisen Fragmente von
[0442] 527 und 6130 Basenpaaren auf.
[0443] Ist der Gegenstrang in entsprechender Weise integriert, so resultieren Fragmentgrδßen von
[0444] 595 und 6062 Basenpaaren.
[0445] 3 Testklone zeigten das für korrekten Einbau typische Ncol- Bandenmuster. Einer von ihnen wurde unter der Bezeichnun pSA 360 für die nachfolgende Proteinanalytik weiterkulti viert.
[0446] [vgl. Abb. 15, pSA 360]
[0447] D) Expressions-Produkte
[0448] D 1. Umklonierung der ACTH-Expressionsplasmide in E.coli E 15
[0449] Als alternativer phoA-negativer Wirtsstamm für die Isolieru und Charakterisierung von phoA-Fusionsproteinen besitzt E.c li E 15 (s. S. 10) wesentliche Vorteile gegenüber SB 44. Ei mal fehlt ihm die Amber-Suppressormutation supE, d.h. die den ACTH 1-24-Hybridgenen pSA 172 und pSA 353 verwendet TAG-Tripletts werden, anders als in SB 44, strikt als Stop Codons gelesen, zum anderen liegen die Proteinausbeuten b E 15-Klonen unter vergleichbaren Kulturbedingungen deutli höher als bei homologen SB 44-Klonen.
[0450] Aus diesen Gründen wurden 5-10 μg Aliquots der in den vora gehenden Abschnitten C 1. bis C 10. beschriebenen ACTH-Pla mide unter Standardbedingungen [vgl. M. Dagert und S.D. Eh lich, Gene _6_T 23-28 (1979) ] in E 15 umkloniert. Der für ei erfolgreiche Transformation benötigte relativ hohe DNS-Übe schuß ist deshalb erforderlich, weil E.coli E 15, anders a SB 44, über ein aktives Restriktions- und Modifikationssyst verfügt.
[0451] D 2. Analytische Bestimmung von Fusionsproteinen und der Clostridiopeptidase A-Spaltprodukten
[0452] Die Herstellung, Spaltung und Charakterisierung von ACTH-F sionsproteinen zu analytischen Zwecken erfolgte gemäß d unter A 5. bis A 6.6. beschriebenen Standardbedingungen. Na Fermentation der entsprechenden phoA-ACTH-Klone in Niedri phosphat-Medium wurden die Fusionsproteine isoliert und mi tels SDS-Gelelektrophorese und Ko-Elektrophorese von Eichpr teinen deren Molekulargewicht bestätigt. Sie sind, neb einigen anderen charakteristischen Daten, für die zuvor b schriebenen Klonierungsbeispiele in Tab. 1 zusammengestell Tab. 1: Zusammenfassung einiger Daten für die beschriebenen phoA-ACTH-Klone einschließlich der Molekularge¬ wichte ihrer Expressionsprodukte
[0453]
[0454] Alle Klone produzieren die erwarteten Fusionsproteine in gu ten Ausbeuten als unlösliche Cytoplasma-Bestandteile. Einig Einzelbeispiele sind in den Abbildungen 16-20 dokumentiert. Nach Spaltung mit Kollagenase findet man die erwarteten Gly Pro-ACTH-Anteile (Abb. 18 und 19) neben den entsprechende Restanteilen der alkalischen Phosphatase (Abb. 18-20) . Di Identität der Proteinbanden ließ sich jeweils durch Standard 'Immun-Blotting'-Tests sichern.
[0455] D 3. Bestimmung der Produktbildung pro Zeiteinheit ^"durc Clostridiopeptidase A-Spaltung von 4 ACTH-Klonen mi unterschiedlicher Zahl von Kollagenase-Schnittstellen
[0456] Diese Versuche gestatten eine quantitative Abschätzung de pro Zeit- und Enzym-Einheit spaltbaren Mengen an ACTH-Fu sionsprotein mit Clostridiopeptidase A in Abhängigkeit vo der Anzahl (n) repetitiver Kollagenase-Erkennungssequenzen Gemäß den bei H. Scheidecker et al. , Deutsches Aktenzeichen P 37318 ⁽1987) ] angegebenen Bedingungen wurden die Fusionsproteine der Klone E 15 (pSA 186) , E 15 (pSA 343) , E 15 (pSA 341) und E 15 (pSA 360) mit limitierten Mengen gereinigter Kollagenase [vgl. oben genannte Deutsche Patentanmeldung ^~~ in
[0457] 100 μl Reaktionsvolumina umgesetzt. Die Bestimmung der Klon¬ spezifischen Freisetzung von Spaltprodukten nach zeitabhängi¬ ger Entnahme von 10 μl-Aliquots durch deren densitometrische Bestimmung nach gelelektrophoretischer Abtrennung und Färbung mit Coomassie-Blau erfolgte ebenfalls nach der oben zitierten Beschreibung. Die Mittelwerte aus je 3 parallel ausgeführten Testserien mit unterschiedlichen Enzymkonzentrationen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
[0458] Tab. 2
[0459] Herkunft des Zahl der repetivien Produktbildungsrate Fusionsproteins Kollagenase- (pMol/Min/Enzym¬ Schnittstellen einheit) n
[0460] E 15 (pSA 186) 1 < 0.01
[0461] E 15 (pSA 343) 2 40
[0462] E 15 (pSA 341) 5 350
[0463] E 15 (pSA 360) 8 540
[0464] Wie der Vergleich der Produktbildungsraten zeigt, ließ sich die erwartete Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeiten durch Erhöhung der Anzahl repetitiver Kollagenase-Erkennungssequen¬ zen in vollem Umfang bestätigen. D 4. Herstellung und Isolierung von ACTH aus einer 10 1-Fer- menterkultur des Klons E 15 (pSA 341)
[0465] D 4.1. Vorkulturen
[0466] 30 ml LB-Medium [T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in: 'Molecular Cloning', S. 440, Cold Spring Harbor Lab., New York (1982) ] mit 100 μg/ml Ampicillin werden mit einer Ein¬ zelkolonie von E 15 (pSA 341) inokuliert und für ca. 16 Std. bei 37 °C schüttelinkubiert. Die ausgewachsene Zellkultur dient zur Beimpfung einer zweiten Vorkultur mit 800 ml des gleichen Mediums, die unter identischen Bedingungen schüttel¬ inkubiert wird.
[0467] D 4.2. Hauptkultur
[0468] Dazu werden zweckmäßigerweise 7 1 H_0 mit 2.2 1 einer steril¬ filtrierten Lösung von 0.2 g L-Prolin, 0.2 g '—Leucin, 10 g Casamino acids [Difco Lab. Detroit, USA] und 10 mg Vitamin B 1 in ,545fach konzentriertem Niedrigphosphat-Medium [vgl. LP-Medium nach K. Kreuzer et al. , Genetics 8_1, 459-468 (1975) ] und den 0.8 1 Vorkultur in einem geschlossenen Glas- fermenter mit 15 1 Fassungsvermögen kombiniert und für 6 Std. bei 37 °C mit 10 1 Luft/Min (0.7 atü Überdruck) und einer Rührerdrehzahl von 220 min gerührt. Die anschließende Sedi¬ mentation der Bakterienzellen mittels einer " DurchlaufZentri¬ fuge des Typs Sharples T-1A [Deutsche Sharples GmbH, 4100 Duisburg-Meiderich] ergibt eine Zellausbeute von ca. 30 g Feuchtgewicht.
[0469] D 4.3 Zellaufschluß
[0470] Die 30 g Niedrig-Phosphat-Zellen werden mittels eines Disper- giergerätes vom Typ Ultra-Turrax T 25 [Fa. Jahnke & Kunke GmbH & Co., Kg, 7813 Staufen] in 300 ml 50 mM Tris/HC pH 7.5, 160 mM NaCl, 20 mM MgCl_ resuspendiert, mit 200 μ DNase I [Boehringer/ Mannheim], 300 μg Pepstatin A un 10 mg Phenyl-methyl-sulfonylchlorid (PMSF) [Sigma Chemie vgl. A 6.3.] versetzt und im Kühlraum auf 2-4 °C temperiert Ein vollständiger Zellaufschluß unter den genannten Tempera turbedingungen läßt sich durch Einsatz des Hochdruckhomogeni sators 15M-8TA [Fa. Manton Gaulin S.A., Hilversum/NL] nac 3 Umlaufzyklen bei 9000-12000 Psi erreichen. Anschließen temperiert man zur DNase-Verdauung für 1 Std. auf 0 °C.
[0471] D 4.4. Protease-Inaktivierung
[0472] Nach 1 Std. Zentrifugation des Homogenisats bei 0-2 °C un 24000 x g wird das erhaltene Sediment in 400 ml 50 M Tris HC1 pH 8.0, 160 mM NaCl resuspendiert und wie oben sedimen tiert. Dieser Waschvorgang wird wiederholt. Danach resuspen diert man das von löslichen Zellkomponenten freie Sedimen mittels Ultra-Turrax T 25 [Fa. Jahnke & Kunkel GmbH & Co. KG 7813 Staufen] in 100 ml 8 M Guanidinhydrochlorid in 50-m Tris/HCl pH 8.0 und erhitzt für 1 Std. auf 95 °C. Unlöslich Anteile lassen sich durch eine nachfolgende Zentrifugatio von 20 Min. bei 40000 x g sedimentieren und werden verworfen
[0473] D 4.5. Kollagenase-Spaltung
[0474] Der klare 8 M-Guanidinchlorid-Extrakt wird zunächst 30 Min gegen 2 1 H„0, danach zweimal für 4 Stunden gegen je 2 50 mM Tris/HCl pH8.0, 160 mM NaCl dialysiert. Dabei erhäl man zu 70-80 % reines Fusionsprotein in unlöslicher Form al feindisperse Suspension zurück. Die Dialysat-Suspension wir mit 10 Einheiten gereinigter Clostridiopeptidase A [vgl A 6.6.] und 15 ml 0.5 M Tris/HCl pH 8.0, 50 mM CaCl₂ versetz und mit 50 mM Tris/ HCl pH 8.0, 160 mM NaCl zu 150 ml Reak tionsvolumen ergänzt. Es folgen 3 Std. Schüttelinkubation i 37 °C-Wasserbad. D 4.6. Aufarbeitung der Reaktionsprodukte
[0475] D 4.6.1. Adsorption an Kieselgel
[0476] Unlösliche Rückstände der Kollagenase-Verdauung lassen sic durch 30 Min. Zentrifugation mit 45000 x g sedimentierten. Mittels eines Mischrotors vom Typ 'Roto-Torque' [Fa. Cole Parmer Ins r. Co., Chicago, Illinois, USA] wird der klar Zentrifugationsüberstand mit 30 g Kieselgel Mallinckrodt 100 esh [Serva Feinbiochemica GmbH & Co. , 6900 Heidelberg 1 in einer verschlossenen Flasche für 30 Min. rotationsgemisch [R.A. Donald, J. Endocrin 3_9_, 451-452 (1967) ]. Das Adsorben war zuvor durch Anschlämmen mit H_0 und Absaugen mittels ei ner G3-Glasfritte angefeuchtet worden. In gleicher Weise er folgt auch die Rückgewinnung des Kieselgels nach quantitati ver Adsorption der Kollagenase-Reaktionsprodukte, überwiegen Gly-Pro-ACTH. Dieses Material kann problemlos bei 0 °C fü 10-20 Std. aufbewahrt werden. Durch 60 Min. Mischrotation (s oben) mit 100 ml eines Aceton/Wasser/Essigsäure-Gemische (Volumenverhältnisse 20:79:1) lassen sich die am Kieselge fixierten Peptide desorbieren und können nach Absaugen de Adsorbens (s. oben) als weitgehend klares Eluat erhalten wer den. Unter Benutzung eines Rotationsverdampfers wird bei ei ner Badtemperatur von 30-35 °C auf ca. 30 ml eingeengt. Ge ringe Restverunreinigungen durch Kieselgel können mittel 15 Min. Zentrifugation bei 30000 x g sedimentiert werden.
[0477] D 4.6.2. Gly-Pro-ACTH-Isolierung mittels 'Reversed Phase'- Chromatographie
[0478] Für die nachfolgend beschriebenen säulenchromatogrphische Reinigungsschritte wurden überwiegend vorgepackte Trennsäule und das Fast Protein Liquid Chromatograph (FPLC) -System d Fa. Pharmacia [Deutsche Pharmacia GmbH, 7800 Freiburg 1] ei gesetzt. Das Kieselgeleluat wird an einer PepRPC HR 16/10 Säule fixiert und mit einem linearen 450 ml-Gradienten v 10 mM KH-PO. in 0 (Puffer A) - 50 % (Puffer B) Acetonitril 5 ml-Volumina bei einer Durchflußrate von 5 ml/Min. fraktio niert eluiert. Die Gly-Pro-ACTH-Peakfraktionen lassen sic bei etwa 27,5 % Acetonitrilgehalt (ca. 55 % Puffer B) nac der Lichtabsorption bei 214 nm photometrisch identifizieren Sie werden vereinigt und am Rotationsverdampfer (s. oben) z 3-4 ml eingeengt. Die Entfernung des Phosphatanteils geling durch Standard-Gelfiltration über eine 60 x 2,6 cm Sephade G-10-Säule mit Wasser als Elutionsmittel. Die bei 280 nm pho tometrisch ermittelten Peakfraktionen können, wie oben be schrieben, zu 5 ml konzentriert werden.
[0479] D 4.6.3. Identitätsnachweis für Gly-Pro-ACTH
[0480] Die Identität des isolierten Gly-Pro-ACTH ließ sich nach zwe Methoden sicherstellen:
[0481] a) Nach dem ' Immun-Blotting' -Verfahren [vgl. Standardsvor schriften A 5. und A 6.6] unter Verwendung eines ACTH Antiserums aus Kaninchen als primären Antikörper. b) Durch Peptidsequenzierung nach B. Wittmann-Liebold un M. Kimura [in Proteins Vol. _1_, ed. J.M. Walther, Human Press, Clifton, New Jersey (1984) ]. Danach ließ sic die Sequenzfolge der 5 aminoterminalen Aminosäure
[0482] Gly-Pro-Ser-Tyr-Ser sicher nachweisen.
[0483] D 4.7. Enzymatische Umsetzung von Gly-Pro-ACTH mit Post- Prolin-Dipeptidyl-Aminopeptidase (PPDA)
[0484] Die spezifische Abspaltung des N-terminalen Glycylprolyl Restes führt zu nativem Corticotrophin. Dazu werden die 5 m der gereinigten Gly-Pro-ACTH-Fraktion (vgl. D 4.6.2.] mi 360 μg zu 50 % gereinigter PPDA (systematische Bezeichnun Dipeptidyl-Peptidase IV (E.C. 4.4.14.5.) , [Reinigung nac Tadash, Yoshimoto, Walter, BBA 485, 391-401 (1977) ] für 3 St bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird das Reaktionsgemisc direkt zur säulenchromatographischen Aufreinigung eingesetzt D 4.8. Aufarbeitung des Reaktionsproduktes
[0485] D 4.8.1. ACTH-Isolierung mittels 'Reversed Phase' -Chromato¬ graphie
[0486] Die Auftrennung des Reaktionsgemisches mittels einer PepRPC HR16/10-Säule erfolgt wieder unter den in Abschnitt D 4.6.2. beschriebenen technischen Bedingungen mit Ausnahme des Elu- tionsmittels. Der lineare Gradient setzt sich in diesem Fall aus 225 ml 0.1 % Trifluoressigsäure in H₂0 (Puffer A) und 225 ml 0.1 % Trifluoressigsäure in 60 % Acetonitril (Puffer B) zusammen. Die ACTH-Peakfraktionen lassen sich bei etwa 29.4 % Acetonitril (ca. 49 % Puffer B) nach der Lichtabsorp¬ tion bei 214 nm photometrisch identifizieren (vgl. Abb. 21) .
[0487] D 4.8.2. Identitätsnachweis für ACTH
[0488] Experimentelle Daten für die Identität des Peakmaterials als reines ACTH lassen sich nach drei Methoden gewinnen:
[0489] a) Nach dem 'Immun Blotting'-Verfahren unter Verwendung eines ACTH-Antiserums aus Kaninchen als primärer Anti¬ körper. Dabei handelt es sich um eine modifizierte Durchführung des bereits beschriebenen Verfahrens [vgl. A 5.], bei der das Probenmaterial neben 0.1-10 μg-Ali- qots von authentischem Human-ACTH [Fa. Bachern AG, CH-4416 Bubendorf] direkt auf BA85-Nitrocellulosemem- branen [Schleicher & Schüll, 3354 Dassel] fixiert und nach der Standardmethode (s. oben) weiterbehandelt wird. b) Durch vergleichende Dünnschichtchromatographie an Kie¬ selgel 60 [Merck, Darmstadt] gegen authentisches Huma ACTH [Fa. Bachern, s. oben] Aliquots des Peakmaterials aus D 4.8.1. zeigen identische R^-Werte in
[0490] Isopropanol : konz. NH_ 1:1 (R -Wert 0.7) Gly-Pro-ACTH weist im gleichen Laufmittelsystem einen R -Wert von 0.5 auf. c) Durch Peptidsequenzierung nach B. Wittmann-Liebold und M. Kimura [in: Proteins Vol. JL, ed. J.M. Walther, Huma¬ na Press, Clifton, New Jersey (1984) ]. Danach ließ sich die Sequenzfolge der 9 aminoterminalen Aminosäuren
[0491] Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp sicher nachweisen. d) Durch Nachweis eines einheitlichen Produkt-Peaks nach analytischer 'Reversed Phase'-Chromatographie über eine Pep RPC HR 5/5-Säule im isokratischen System. Die Re- tentionszeit ist mit der einer Vergleichsprobe von au¬ thentischem ACTH identisch (vgl. Abb. 22) .
[0492] Abb. 15: SDS-Gelelektropherogramm von Proteinextrakten aus
[0493] E. coli SB 44 (phoA, supE) und E. coli E 15 (phoA) mit den Plasmiden psB 94 [natives phoA-Gen, vgl. Parallelanmeldung Dr. G. Siewert et al., (1987)], psA 172 (phoA/ACTH 1-24) und psA 186 (phoA/ACTH 1-39)
[0494]
[0495]
[0496] 2 3
[0497] 1. Gereinigte alkalische Phosphatase (MW 47 147)
[0498] 2. Wirtsstamm E. coli SB 44 (plasmidfrei)
[0499] 3. E. coli SB 44 (psB 94)
[0500] Molekulargewicht des Präpeptids der alkalischen Phosphatase: 49 383
[0501] 4. E. coli SB 44 (pSA 186)
[0502] Molekulargewicht des Fusionsproteins Prä-phoA/ACTH 1-39: 51 566 5 . E . coli SB 44 ( pSA 172 )
[0503] Der Klon exprimiert wegen der supE-Mutation ein um 27 Aminosäuren zu langes Fusioπsprotein; MW 52 849
[0504] 6. E. coli E 15 (pSA 172)
[0505] Molekulargewicht des Fusionsproteins Pr -phoA/ACTH 1-24: 49 960
[0506] 7. Wirtsstamm E. coli E 15 (plasmidfrei)
[0507] 8. Molekulargewichts-Marker
[0508] Abb. 17: Herstellung des Prä-phoA/ACTH 1-39-Fusionsproteins aus
[0509] E. coli E 15 (pSA 341) durch Fermentation im 10 1-Maßstab [vgl. D4., S. 51ff]
[0510] SDS-Gelelektropherogra m (12,5 '/ Polyacrylamid)
[0511] 94 000 67 000
[0512] 47 147
[0513] *43 ÖόO (AP, 450 AS)
[0514] 30 000
[0515] 20 100
[0516]
[0517] 1. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 gemäß D 4.4. [vgl. S. 52].
[0518] Die Proteinmenge entspricht 0 , 2 ml Hauptkultur. Molekulargewicht 52 435
[0519] 2. E. coli E 15 (plasmid rei)
[0520] 3. Molekulargewichts-Marker
[0521] 4. Gereinigte alkalische Phosphatase (AP) Molekulargewicht 47 147 Abb. 18: SDS-Gelelektropherogramm von löslichen und unlöslichen Substrat- und Produktanteilen bei der Clostridiopeptidase A-Verdauung des Fusionsproteins Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 341)
[0522] 1. Reaktionsprod (Prä-phoA-Ant
[0523] 30 000 2. Reaktionsprod 20 100 (Gly-Pro- ACTH 1-39) 14 400
[0524] 1. Molekulargewichts-Marker
[0525] 2. Gesamt-Kollagenase-Reaktionsgemisch vor Enzymzugabe Molekulargewicht des Fusionsproteins Prä-phoA/ACTH 1-39: 52 453
[0526] 3. Unlöslicher Anteil des Kollagenase-REaktionsgemisches vor Enzymzugabe (Zentrifugationssediment)
[0527] 4. Löslicher Anteil des Kollagenase-Reaktionsgemisches vor Enzymzugabe (Zentrifugationsüberstand)
[0528] 5. Gesamt-Reaktionsgemisch nach Kollagenase-Verdauung Molekulargewicht des 1. Reaktionsproduktes: 46 863 Molekulargewicht des 2. Reaktionsproduktes: 4 690 (Gly-Pro-ACTH 1-39) 6. Unlöslicher Anteil des Reaktionsgemisches nach Kollagenase-Verdauung (ZentrifugationsSediment)
[0529] 7. Löslicher Anteil des Reaktionsgemisches nach Kollagenase-Verdauung (Zentrifugationsüberstand)
[0530] Abb. 19: Clostridiopeptidase A-Verdauung der Prä-phoA/ACTH 1-39-Fusions- proteine aus E. coli E 15 mit den Plasmiden pSA 341 bzw. pSA 509, Substrate und Reaktionsprodukte nach SDS-Gelelektrophorese (12,5-25 7. Polyacrylamid-Gradient)
[0531] 94 000 67 000
[0532]
30 000
[0533] 20 100 14 400
[0534] 1. Molekulargewichts-Marker
[0535] 2. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 341); Molekulargewicht 52 453
[0536] 3. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 341) Reaktionsprodukt a: Prä-phoA-Anteil
[0537] Molekulargewicht 46 863 Reaktionsprodukt b: Gly-Pro-ACTH 1-39
[0538] Molekulargewicht 4 690
[0539] 4. Marker-Protein ACTH 1-39, Molekulargewicht 4 536 5. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 509) Reaktionsprodukt a: Prä-phoA-Anteil
[0540] Molekulargewicht 46 863 Reaktionsprodukt b: Gly-Pro-ACTH 1-39
[0541] Molekulargewicht 4 690
[0542] 6. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 509) Molekulargewicht 52 527
[0543] 7. Molekulargewichts-Marker
[0544] 8. Marker-Protein ACTH 1-39, Molekulargewicht 4 536
[0545] Abb. 20: Clostridiopeptidase A-Verdauung der Prä-phoA/ACTH 1-39-Fusions- proteine aus E. coli E 15 mit den Plasmiden pSA 341 bzw. pSA 351 Substrate und Reaktionsprodukte nach SDS-Gelelektrophorese (12,5 7. Polyacrylamid)
[0546] 43 000
[0547] 30 000
[0548]
[0549] 1. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 341); Molekulargewicht: 52 453
[0550] 2. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 341),
[0551] 1. Reaktionsprodukt (Prä-phoA-Anteil) nach 6 Std. Clostridiopeptidase
[0552] A-Verdauung
[0553] Molekulargewicht: 46 863
[0554] 3. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 351); Molekulargewicht: 36 710
[0555] 4. Fusionsprotein Prä-phoA/ACTH 1-39 aus E. coli E 15 (pSA 351),
[0556] 1. Reaktionsprodukt (Prä-phoA-Anteil) nach 6 Std. Clostridiopeptidase-
[0557] Verdauung
[0558] Molekulargewicht: 31 271
[0559] _/
[0560] 5. Position von 2 Molekulargewichts-Marker-Proteinen

权利要求:
Claims
Patentansprüche
1 ) Plasmidvektoren, die eine DNS-Sequenz für ACTH oder ACTH-De¬ rivate enthalten und mit denen Bakterien zu Zellen, die die¬ se Vektoren enthalten, transformiert werden können. Plasmid pSA 172 Plasmid pSA 186 Plasmid pSA 341 Plasmid pSA 343 Plasmid pSA 345 Plasmid pSA 353 Plasmid pSA 509
9 Plasmid pHS 6134 10 Plasmid pSA 351 11 Plasmid pSA 360 12 Verfahren zur Herstellung von Plasmidvektoren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man DNS-Insertionsf agmente, die die Codons für ACTH oder ACTH-Derivate 'enthalten und die an beiden Enden Pstl-Erkennungssequenzen besitzen, in die Pstl-Schnittstelle linearisierter und dephosphorylierte Vek¬ torplasmide unter Zuhilfenahme einer geeigneten Ligase einfüg
13) E.coli-Stämme, enthaltend Plasmide mit einem Gen für ACTH oder ACTH-Derivate nach Anspruch 1.
14) E.coli SB 44 (pSA 172) 15) E.coli SB 44 (pSA 186) 16) E.coli SB 44 (pSA 341 ) 17) E.coli SB 44 (pSA 343) 18) E.coli SB 44 (pSA 345) 19) E.coli SB 44 (pSA 353) 20) E.coli SB 44 (pSA 509) 21 ) E.coli SB 44 (pHS 6134) 22) E.coli SB 44 (pSA 351 ) 23) E.coli SB 44 (pSA 360) 24) E.coli E 15 (pSA 343) 25) E.coli E 15 (pSA 341 ) 26) E.coli E 15 (pSA 360) 27) Verfahren zur Herstellung neuer E.coli-Stämme nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man kompetente Zellen des betreffenden Stammes mit der Plasmid-DNS nach Anspruch 1 unter Transformationsbedingungen inkubiert und aus der Zel¬ lenpopulation ACTH-haltige Klone isoliert, die durch ihre Antibiotika-Resistenz identifiziert werden können.
28) Verwendung von E .coli-Stämmen , die ein Plasmid mit einem Gen für ACTH oder ACTH-Derivate enthalten, zur Herstellung von ACTH oder ACTH-Derivaten.
29) Verfahren zur Herstellung neuer E.coli-Stämme nach an sich bekannten Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man kom¬ petente Zellen von E.coli E 15 mit einem hohen Überschuß an Plasmid-DNS nach Anspruch 1 aus E.coli SB k transformier
30) Verwendung von E.coli E 15-Stammen, die ein Plasmid mit einem Gen für ACTH enthalten, zur Herstellung von ACTH.
31 ) Verfahren zur Herstellung von ACTH, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme gemäß Ansprüche 13 - 26 aus einer Vorkultur mit einer wässrigen Lösung von L-Prolin, L-Leucin, Casamino acids , Vitamin B 1 in kon¬ zentriertem Niedrigphosphat-Medium in einem Fermenter kom¬ biniert, bei 37° C und Überdruck rührt und das gebildete ACTH nach bekannten Verfahren isoliert.
32) Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß man die entstandenen ACTH-haltigen Fusionsproteine einer Kolla¬ genase-Spaltung unterwirft und die Reaktionsprodukte unter Vermeidung einer proteolytischen Zersetzung isoliert und anschließend Gly-Pro-ACTH mittels Post-Prolin-Dipeptidyl- Aminopeptidase spaltete
33) Arzneimittel, enthaltend ACTH oder ACTH-Derivate, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 31 hergestellt wurden, und übliche Hilfs- und Trägerstoffe.

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公开号 | 公开日

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EP0379506A1|1990-08-01|

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DE3731875A1|1989-03-30|

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JPH03500242A|1991-01-24|

引用文献:

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公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题

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法律状态:
1989-03-23| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |

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1989-03-23| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |

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1990-01-24| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988907643 Country of ref document: EP |

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1990-08-01| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988907643 Country of ref document: EP |

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1993-05-28| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1988907643 Country of ref document: EP |

优先权:

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申请号 | 申请日 | 专利标题

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